Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy
Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována ani šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.

Prof. MUDr. Jiří Schindler, DrSc.

MIKROBIOLOGIE
Pro studenty zdravotnických oborů
2., doplněné a přepracované vydání

TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE:

© Grada Publishing, a.s., 2014
Zdroje obrázků uvedeny v kapitole Poděkování
Technická kvalita některých obrázků je snížena vzhledem k množství a různé kvalitě zdrojů.
Cover Photo © fotobanka allphoto, 2014

Vydala GRADA Publishing, a.s.
U Průhonu 22, Praha 7
jako svou 5548. publikaci

Odpovědná redaktorka Mgr. Ivana Podmolíková
Sazba a zlom Karel Mikula
Počet stran 224 + 24 stran barevné přílohy
2. vydání, Praha 2014

Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a. s.

Názvy produktů, firem apod. použité v této knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno.

Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění však pro autory ani pro nakladatelství nevyplývají žádné právní důsledky.

ISBN 978-80-247-4771-2

ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE:

ISBN 978-80-247-9275-0 (pro formát PDF)
ISBN 978-80-247-9276-7 (pro formát EPUB)

Úvod

Lékařská mikrobiologie je mikrobiologie člověka pojednávající o původcích onemocnění i o nepatogenních mikrobech v těle a v jeho bezprostředním okolí.

Tato stručná učebnice lékařské mikrobiologie je zaměřena na studenty zdravotnických oborů, především na studentky a studenty bakalářského oboru všeobecná sestra.

Výběr, rozsah a hloubka látky vycházely ze zkušenosti s výukou na tomto stupni a z realisticky pochopených potřeb v praxi. Hlavní snahou je, aby studenti poznali obecné souvislosti existence mikrobů a jejich vztahu k člověku. Cílem není memorování látky, ale její pochopení. Znalosti lékařské mikrobiologie jsou pro zvolený obor studia nástrojem a prostředkem orientace, jejich samostatné používání je však určeno lékařům.

Všichni studenti přicházející do prvního studijního kontaktu s lékařskou mikrobiologií si stěžují na obtížnost systematiky a množství jmen mikrobů, jež mají znát. Jejich stesky lze samozřejmě chápat. Z množství mikrobů byly proto v kapitolách speciální mikrobiologie, virologie, mykologie a parazitologie vybrány druhy, s nimiž se v povolání častěji setkají, nebo které znamenají ohrožení života pacienta. To je však vše, čím lze studium lékařské mikrobiologie ulehčit. Některé druhy mikrobů jsou probírány kvůli hrozbě bioterorizmu, jiné pro možnost epidemického šíření. Jména některých druhů mikrobů jsou uváděna pro seznámení a jako připomínka při případném výskytu v praxi. Každopádně je hlavním cílem studia vědět „Jak?“ a „Proč?“.

Problém výuky virologie u studentů zdravotnických oborů spočívá kromě jiného v tom, že viry pouhým okem nebo jednoduchým mikroskopem „nejsou vidět“. Druhy probíraných virů jsou vybrány podle závažnosti onemocnění, podle praktické potřeby studentů, zejména všeobecných sester, a podle epidemiologické naléhavosti.

Objem informací o virech může pro studenty zdravotnických oborů působit někde nepřiměřeně, je však potřebné poukázat na rozmanitost a komplikovanost ustrojení virů, a zdůraznit tak biomedicínský význam virových infekcí. Je na učiteli, aby své požadavky přizpůsobil svému pedagogickému záměru.

Vydavatelé se snažili umožnit prezentaci co nejvíce obrazového materiálu z archivu autora, případně elektronoptických snímků autorů z významných světových pracovišť. Z technických a ekonomických důvodů však všechny kapitoly nemohly být názorně doplněny dostatečným počtem obrázků, a proto i počet barevných verzí obrázků byl omezen. Je opět na pedagogovi, který je hlavním mediátorem výuky, aby v přednáškách a praktických cvičeních potřebné doplnil.

1Lékařská mikrobiologie

Mikroorganizmy, které žijí v lidském těle, nejsou výhradně škodlivé. Člověk je s některými (převážně bakteriemi) ve vzájemném pozitivním vztahu. Člověk – hostitel – zajišťuje prostředí, z něhož bakterie těží živiny, a jejich metabolity jsou mu prospěšné. Příkladem je Escherichia coli v tlustém střevě, která obstarává menachinon – vitamin K, jenž je zpracováván v játrech při syntéze protrombinu, který má význam pro srážlivost krve. Určité druhy bakterií, virů, hub i prvoků jsou přítomny na sliznicích a na kůži, aniž by vyvolávaly onemocnění. Jsou to organizmy nepatogenní. Vztah člověka jako hostitele a mikrobů je vztahem dynamickým, při němž se mění kvalita i kvantita mikrobů a současně s nimi i reakce organizmu hostitele.

Lékařská mikrobiologie se zabývá jak mikroby, které jsou vysloveně patogenní, tak i takovými, které vyvolávají onemocnění jen za určitých podmínek, nejčastěji při snížení imunity hostitele. Zabývá se i mikroby v bezprostředním okolí člověka, které se na člověka přenášejí, a mikroby, které se na člověka přenášejí ze zvířat. Prvotními a nejdůležitějšími objekty jsou však mikroby patogenní.

Čtyři skupiny mikrobů se vztahem k člověku jsou od sebe více či méně biologicky vzdáleny. Jejich spektrum jde od nebuněčných virů, přes jednobuněčné bakterie schopné již samostatné existence, houby – složitější organizmy s bohatou morfologií s organelami – až po parazitické jednobuněčné prvoky již podobné buňkám vyšších živočichů.

Kromě popisu vlastností těchto mikroorganizmů se lékařská mikrobiologie zabývá způsobem zneškodňování původců onemocnění fyzikálními i chemickými vlivy, zejména antimikrobními látkami – antibiotiky a antivirovými látkami. Lékařská mikrobiologie se také zabývá teorií očkovacích látek a jejich přípravy.

Klinická mikrobiologie se zabývá infekčními onemocněními a podmínkami výskytu nemocničních infekcí u pacientů oslabených základním onemocněním a zároveň vystavených infekci z prostředí. Do tohoto oboru patří i epidemiologie používaná jako nástroj zkoumání šíření infekčních onemocnění v nemocnicích i v komunitě mimo ně. V neposlední řadě k lékařské mikrobiologii patří i zájem o nová a znovu se vyskytující infekční onemocnění.

Nejjednodušší organizmy schopné reprodukce jsou viry. Jsou živé v tom smyslu, že se replikují, nejsou však schopny samostatné existence (života), protože jsou závislé na hostitelské buňce. Jsou nejmenšími infekčními agens s jedním druhem nukleové kyseliny. K replikaci používají v různé míře aparát hostitelské buňky, kterou pak většinou ničí. Jsou tedy parazity na molekulární úrovni, protože využívají makromolekuly, zejména enzymy, pro svou reprodukci. Míra tohoto využívání, tedy míra relativní autonomie, je různá. Jejich původ je předmětem teorií. Podle regresivní teorie viry vznikly únikem z hostitelské buňky. Podle teorie progresivní je základem plazmid nebo transpozon, jehož DNA byla obalena bílkovinou a získala schopnost vniknutí do buňky. RNA viry mají původ v mRNA buňky. Byly by tedy vývojově mladší než bakterie. Koevoluční teorie praví, že se viry jako biologické struktury vyvíjely nezávisle a jsou na počátku vývojové řady organizmů schopných množení. O žádné z těchto teorií nejsou důkazy a vývoj virů je zřejmě provždy tajemstvím.

Bakterie jsou nejstarší organizmy na Zemi. Existuje jich něco mezi 300 000 a jedním milionem druhů, z nichž bylo nalezeno a popsáno na tři tisíce. Bakterie jsou jednobuněčné organizmy, které si mohou obstarat energii a výživu z anorganických zdrojů. Evolucí se však tato vysoká nezávislost na prostředí změnila, některé bakterie se přizpůsobovaly prostředí, ztrácely schopnost stavby těla z anorganických zdrojů, potřebovaly doplnit výživu aminokyselinami, cukry i bílkovinami, a adaptovaly se dokonce na určitého hostitele, ačkoliv mohou růst i na relativně bohaté umělé půdě. Například Streptococcus pyogenes se vyskytuje jen u člověka. Některé bakterie ztratily schopnost růstu mimo buňku a jsou obligatorními intracelulárními parazity. Jejich strategií je množit se s co nejmenším vynaložením energie, což je vedlo k parazitizmu. Paradoxně však působí skutečnost, že činnost patogenu vede k smrti hostitele, čímž však je ohrožen sám patogen, protože logicky ztrácí možnost další existence.

Houby jsou mikroorganizmy s rozvětvenými vlákny – myceliem, která mají průchodné přepážky, jsou mnohojaderná a cytoplazma či nukleové kyseliny jimi procházejí. Nepravé houby jsou kvasinkovité organizmy, buď jednobuněčné, nebo tvoří mnohobuněčná vláknitá pseudomycelia.

Protozoa jsou jednobuněčné eukaryotické (mají jádro) organizmy s organelami. Některé mají bičíky, jiné se pohybují pomocí pseudopodií jako améby.

2Bakteriální buňka

V průběhu evoluce trvající miliony let se bakterie rozrůznily jak ve způsobu života, tak svým tvarem a velikostí. Jejich velikost je od 0,2 µ až po 0,75 mm, některé druhy rostou při 0 °C a jiné při 113 °C, při pH 0,06 a pH 12, při tlaku více než 1000 atm, nebo v 32% nasyceném roztoku NaCl. Vlastnosti bakterií v okolí člověka jsou dány charakterem jeho životního prostředí a vlastnostmi hostitele.

2.1Morfologie

Morfologie bakterií se studuje mikroskopickými metodami. V diagnostice se běžně používá pozorování obarvených usmrcených bakterií, v praxi kombinované Gramovo barvení. To kromě znázornění tvaru bakterií vypovídá o jejich charakteru – bakterie grampozitivní se od bakterií gramnegativních liší strukturou a jinými vlastnostmi, včetně mechanizmu infekce.

Velikost nejmenšího objektu, který lze spatřit (při dané vlnové délce světla) světelným mikroskopem, je dána jeho rozlišovací schopností. Je to nejmenší vzdálenost dvou bodů (objektů), které lze jako dva body rozlišit. Užitečné zvětšení mikroskopu je takové zvětšení, jež umožní pozorovat objekt nejmenší rozlišitelné velikosti. Celkové zvětšení mikroskopu je dáno součinem zvětšení objektivu (např. 100×) a okuláru, kterým se zvětšený obraz pozoruje (např. 10×) (obr. 2.1). Konfokální mikroskop umožňuje ostře pozorovat objekt v rovině zaostření a překrýt obraz v rovinách nad a pod rovinou zaostření. Procházením rovin lze získat trojrozměrný obraz objektu. Obraz se zpracovává elektronicky pomocí vestavěného počítače. Jako zdroj světla se používá laserový paprsek, rozlišovací schopnost tohoto typu mikroskopu je proto větší než obyčejného světelného mikroskopu.

Obr. 2.1 Mikroskop starého typu dnes nepoužívaný (vlevo) a současný jednoduchý laboratorní mikroskop (vpravo). Hlavní části: A) objektiv (vpravo binokulární), B) sada objektivů na otočném měniči, C) kondenzor světla, D) zdroj světla (vlevo světlo z lampy odráží vzhůru zrcátko), E) zaostřovací šroub, F) stolek pro pozorovaný objekt

Elektronový mikroskop pracuje s elektrony, které mají menší vlnovou délku, má větší rozlišovací schopnost a umožňuje vyšší zvětšení. Paprsek elektronů buď objektem (např. ultratenkým řezem bakterie) prochází, nebo se od objektu (celé bakterie) odráží. Transmisivní elektronová mikroskopie pracuje s paprskem elektronů podobně jako světelný mikroskop se světelným paprskem. Procházející elektrony se zachycují, obraz se zvětší a fotografuje. Metoda umožňuje pozorovat detaily buňky a virových částic. Ke kontrastnímu znázornění zvýraznění struktur se používá negativní barvení solemi těžkých kovů, které nepropouštějí elektrony (jedná se např. o uranyl acetát nebo molybdenan amonný). Rastrovací elektronová mikroskopie znázorňuje povrch objektu (bakterie, viru, leukocytu) tence potažený paprskem iontů kovu, např. platiny. Protože se pokovuje pod ostrým úhlem v místech, kam se kovové ionty nedostanou, vznikají stíny. Výsledkem je plastický trojrozměrný obraz.

Tvar a velikost bakterií

Velikost bakterií významných pro medicínu se pohybuje v řádu tisícin milimetru (μ). Stafylokoky a streptokoky jsou kulovité bakterie o průměru přibližně 1 μ. Kulovité bakterie jsou koky, tyčky různé délky buď pravidelného, nebo nepravidelného tvaru. Tyčky mohou mít tvar kyjovitý s rozšířením na jednom pólu (korynebakteria), rohlíčkovitý (vibrio), obloučkovitě nebo esovitě zprohýbaný (kampylobakter), spirálový či spíše vývrtkový (treponema), některé s nepravidelným stoupáním závitu (borrelie) (obr. 2.2). Některé tyčky se za podmínek prostředí prodlužují do vláken (např. Escherichia coli v moči, legionely). Bakterie mohou být vyduté sporou uvnitř cytoplazmy, uprostřed (centrálně), nebo na konci těla (subterminálně, terminálně). Aerobní sporulující bakterie jsou bacily, anaerobní klostridia (vypadají jako vřeteno – closter).

Obr. 2.2 Základní morfologické tvary bakterií

2.2Cytologie

Navenek je bakterie ohraničena cytoplazmatickou membránou, tuhou a pevnou buněčnou stěnou, u grampozitivních bakterií silnější, u gramnegativních tenčí, které ještě mají na sobě složitou vnější membránu. S okolním prostředím se bakterie stýkají strukturami důležitými pro přilnutí buňky hostitele, pro pohyb, pro přenos genetické informace na jiné bakterie i jako čidla stavu vnějšího prostředí.

Bakteriální chromozom je tvořen jedinou molekulou dvouvláknové DNA, která je do sebe uzavřena. Vzhledem k délce buňky je velmi dlouhá, u E. coli měří 1 mm (obr. P1). Dvoušroubovice DNA je dalším stočením zavinuta do nepravidelné struktury a pak svinuta do klubka. Aby klubko drželo pohromadě, je zpevňováno třemi bílkovinami. (Tento útvar se nazývá nukleoid, protože neobsahuje jen DNA, ale v malém množství i RNA a podobně jako jádro eukaryot i bílkovinu [přípona -oid naznačuje, že jde o podobnost jádru]) Chromozom nese geny a jejich soubor se označuje jako genom. Nejmenší bakteriální chromozom se skládá z 600 kilobází (kB), největší má 10 000 kB. Chromozom E. coli má asi 4500 kB a obsahuje na 4405 genů. Chromozom E. coli je dlouhý asi 1400 µ a při šetrném lyzování buňky je dobře patrna rozvinutá struktura. DNA určuje přímo transkripci – přepis či okopírování určitého úseku DNA na mRNA. Na ribozomech probíhá podle kódu na mRNA translace, což je řetězení aminokyselin do peptidového (bílkovinného) řetězce. Aminokyseliny přivádí na ribozom, kde je již navázána mRNA, přenosová či transferová molekula ribonukleové kyseliny – tRNA. Každá tRNA je pro danou aminokyselinu specifická a přináší jenom ji. Výběr se řídí podle kódu, který na aktuálním úseku mRNA přečte. Tak geny řídí syntézu bílkoviny, kterou určují.

Cytoplazma nemá endoplazmatické retikulum. Obsahuje ribozomy, jež jsou nástrojem proteosyntézy (obr. 2.3). Skládají se ze dvou podjednotek, jsou asi 10–20 nm velké, v buňce jich je několik tisíc. Při sestavování molekul bílkovin jsou jakoby navlečeny na mRNA, jež obsahuje informaci, kterou aminokyselinu má právě tRNA napojit na polypeptidový řetěz. Některé druhy bakterií mají v cytoplazmě inkluze, z nichž jsou nejvýznamnější volutinová granula charakterizující Corynebacterium diphtheriae. Slouží jako zásoba energie.

Obr. 2.3 Ribozom prokaryotických buněk složený ze dvou částí značených podle hmotnosti 50 S a 30 S (CDC ATB)

Cytoplazmu ohraničuje dvouvrstvá fosfolipidová cytoplazmatická membrána. Má jemnou strukturu, její povrch se elekronopticky ozřejmí speciální technikou odlomení. Obsahuje enzymy permeázy, které selektivně transportují látky, tj. živiny dovnitř, katabolity ven z buňky. Jsou na ní též enzymy, které syntetizují buněčnou stěnu.

Cytoplazmatická membrána naléhá na tuhou buněčnou stěnu, která určuje tvar bakteriální buňky a chrání ji mechanicky zvnějšku. Zevnitř odolává osmotickému tlaku (obr. 2.4). Když se buňka zbaví stěny, praskne. Pokud na buňku grampozitivní bakterie působí enzymem lysozymem, musí se vyrovnat vnější osmotický tlak sacharózou a z buňky se stane kulovitý protoplast. Buněčná stěna je pevná, silná kolem 20 nm, propouští molekuly menší než 1 nm. Je složena z řetězových makromolekul peptidoglykanu (murein nebo glykopeptid) síťovitě pospojovaných oligopeptidy. Tato struktura způsobuje její pevnost, tuhost a určitou omezenou elasticitu. Je silnější u grampozitivů, které obsahují ještě významnou kyselinu teichoovou. Buněčnou stěnu syntetizují enzymy transpeptidázy, které mohou také na sebe vázat penicilin (PBP – penicillin binding proteins) a tím být inaktivovány. Gramnegativní buňky mají ještě vnější membránu. Je hlavní permeabilní bariérou. Její strukturu lze z náhledu vidět elektronovým mikroskopem. Propouští pasivně vodu a selektivně některé látky s malou molekulou. V membráně jsou bílkoviny – poriny, jež propouštějí látky s malou molekulou. Dvě molekuly porinů k sobě přiléhají, mezi nimi je pór, otvor, kterým molekuly procházejí do periplazmového prostoru a poté cytoplazmatickou membránou do nitra buňky (obr. 2.5).

Obr. 2.5 Stavební součásti buněčné stěny a vnější membrány (CDC ATB)

Obr. 2.4 Ohraničení bakteriální buňky proti prostředí (CDC ATB)

Vnější membrána chrání peptidoglykan před účinkem lysozymu a je na ní vázán lipopolysacharid s výrazným biologickým účinkem. Mezi ní a buněčnou stěnou je periplazmový prostor, v němž jsou enzymy, které mají rozličnou funkci: transport, štěpení a pohyb. Jsou tu i β-laktamázy, enzymy inaktivující penicilin a jemu příbuzné β-laktamy. Grampozitivní bakterie tento prostor nemají a enzymy vylučují do prostředí, kde štěpí makromolekulární látky, např. bílkoviny. Štěpy o menší molekule se pak snadněji dostanou do buňky.

Na povrchu některých bakterií je dobře patrné pouzdro až 1 µ silné, které do určité míry chrání buňku před nepříznivými vlivy prostředí a zabraňuje fagocytóze – pohlcení leukocyty. Je většinou polysacharidové povahy (Streptococcus pneumoniae), někdy polypeptidové (Bacillus anthracis) či velmi tenké z kyseliny hyaluronové (Streptococcus pyogenes). Pouzdro, např. u pneumokoků, má specifickou antigenicitu, takže protilátky proti pneumokoku jednoho antigenního typu nechrání před infekcí jinými typy. Očkovací látka proti pneumokokovým infekcím proto musí obsahovat směs antigenních typů nejčastěji vyvolávajících infekce. Pneumokokové kmeny se typizují pomocí antisér proti jednotlivým typům. Specifické antisérum způsobí zbobtnání pouzdra, jež se pozoruje v mikroskopu. Polymerní hmota na povrchu bakterie je glykokalyx, produkovaná za určitých podmínek. Může to být pouzdro nebo neorganizovaná hlenová vrstva. Je nástrojem tvorby biofilmu, protože zajišťuje přilnutí na pevný povrch – na sliznici, zubní sklovinu, implantát. Oba pojmy, pouzdro a glykokalyx, se proto významově oddělují.

Bičíky jsou silné kolem 20 nm, tedy asi padesátkrát tenčí než šířka bakterie. Jsou křehké a snadno se odlamují (obr. 2.6). Běžným barvením nejsou vidět. V optickém mikroskopu je lze spatřit až po speciálním barvení, např. po impregnaci stříbrem. Bičík může být na pólu buňky jen jeden, nebo jich je více uspořádaných jako koňský ohon. Bičíky mohou pokrývat celé tělo bakterie (u salmonel, Escherichia coli nebo některých bacilů).

Obr. 2.6 Dlouhé bičíky E. coli neporušené preparací

Elektronová mikroskopie umožnila poznat strukturu bičíku a mechaniku pohonu buňky. Bičík je složen z bílkovinných stavebních jednotek šroubovitě na sebe naskládaných. Vlákno bičíku se nehýbe jako bič, ale pohybuje se šroubovitou rotací po celé délce, je poháněno složitou bílkovinnou turbínou, již do pohybu uvádí proud protonů. Vnější vláknitá část bičíku je vsazena do duté ohnuté spojky, která může převádět rotační pohyb ve své ose. Spojka sedí na vnější membráně buňky a spojuje vlákno bičíku s motorem, který bičíkem pohybuje (obr. P2). Motor je složen ze šesti částí. Je pevně usazen v periplazmovém prostoru. Funguje podobně jako elektromotor, ale rotor roztáčí proud protonů nebo iontů sodíku procházejících do buňky. Točivý moment se přenáší na hřídel a přes ohebnou spojku na vlastní bičík.

Bičíky E. coli rotují ve svazku rychlostí asi 18 000 otáček za minutu a posunují bakterií o 30 µ za vteřinu. Urazí tak desetinásobek své délky stejně jako automobil jedoucí rychlostí 100 km/hod. Bičíky se točí doleva a chvílemi se směr rotace obrátí. Pohyb chemotaxí směřuje ke zdroji živin nebo od toxických látek. Bakterie, které nemají bičíky, se mohou pohybovat jinými způsoby, např. klouzáním a trhavými pohyby těla.

Povrch buněk některých bakterií je pokryt kartáčkovitými výběžky – fimbriemi, jež vypadají jako chloupky, a proto se označují termínem pili (obr. 2.7). Jsou také složeny z bílkovin ve šroubovicovém uspořádání. Mají několikerou funkci: adherují na povrch sliznice, zakládají biofilm i na pevné neživé podložce. Fimbrií je několik typů. Fimbrie typu 1 na povrchu enterobakterií se vážou na glykoproteinové receptory buněk sliznice. Fimbrie typu 4 adherují i na bakterie, jsou relativně dlouhé, mohou smrštit a přitáhnout si buňku, na kterou se navázaly. Jsou to fimbrie sex-specifické, přítomné jen na samčích buňkách enterobakterií, a jsou nástrojem konjugace a přenosu DNA na jinou buňku.

Obr. 2.7 Elektronoptický snímek E. coli s dlouhými bičíky a krátkými fimbriemi, získaný speciální řádkovací technikou

Spory jsou klidové formy, které tvoří některé vegetativní bakterie při nepříznivých podmínkách, jako je vysušení, hladovění, vysoká teplota. Sporami si buňka zachovává život i při těchto podmínkách, ačkoliv má všechny životní funkce zastavené (obr. 2.8, 2.9). Spory jsou rezistentní k vysoké teplotě (100 °C), organickým rozpouštědlům a dezinfekčním látkám, iradiaci, kyselinám. Ačkoliv mají zastavený metabolizmus, reagují na restituci podmínek, které umožňují život původní vegetativní buňce, a klíčí – germinují. Mají složitou strukturu, uvnitř je dřeň obklopená vnitřní membránou, kůrou, obalem a vnějším exosporiem. Spory tvoří aerobní grampozitivní bakterie rodu Bacillus (Bacillus anthracis) a anaerobní rodu Clostridium (Clostridium tetani). Tělo buňky se většinou sporami vydouvá. Ničí se autoklavací – vystavení teplotě 120 °C po dobu 20 minut.

Obr. 2.8 Umístění spor uvnitř tyčinkovitých buněk Bacillus cereus

Obr. 2.9 Spory uvnitř buňky. Elektronoptický snímek řezu buňkami Bacillus anthracis

2.3Růst a množení bakterií

Růst jedné individuální bakteriální buňky, to znamená zvětšování jejího objemu, syntézu makromolekul a vedlejších metabolitů až do momentu, kdy je růst dokončen, nelze sledovat (a pro praxi nemá velký význam). Před ukončením růstu se bakterie rozdělí, obě buňky, teoreticky rovnocenné, pokračují v růstu a cyklus se opakuje.

2.3.1Růst v tekuté půdě

Velikost populace bakterií živých i mrtvých lze sledovat:

■přímo počítáním buněk v určitém (malém) objemu mikroskopem,

■měřením zákalu, který např. v jednotkovém objemu kultivační půdy způsobí nejméně statisíce buněk,

■vážením sušiny buněk odebraných z kultivační půdy.

(U obou posledních metod je ovšem nutné zákal, respektive hmotnost bakterií kalibrovat na počet buněk.)

Odběry a měření se mohou dít opakovaně ve zvolených časových intervalech a podle toho lze poznat průběh růstu populace bakterií, která se za laboratorních podmínek pěstování označuje jako kultura bakterií.

Předpokládejme, že se jedna bakterie dostane do tekutého živného prostředí. To lze provést experimentálně v laboratoři za optimálních podmínek. Tato jedna bakterie se za určitý čas rozdělí na dvě. Ony dvě buňky se rozdělí a v médiu jsou již čtyři, ze čtyř je pak osm atd. Evidentně lze předvídat, kolik by na konec teoreticky mohlo být v dané půdě bakterií, neboť konečný počet buněk B by byl 1 × 2n. Tedy:

B = B_0 × 2n,

kdy B_0 je počet bakterií na počátku a n počet generací.

Generací se rozumí zdvojení počtu buněk. Buňky se rozdělují v určitém čase, což je tzv. generační doba. Čím je generační doba kratší, tím roste populace rychleji. Platí, že za optimálních podmínek je generační doba E. coli 20 minut, generační doba Mycobacterium tuberculosis je při kultivaci v laboratoři 36 hodin. Rychlost množení c je dána počtem generací za jednotku časovou t, např. za hodinu:

c = n/t

Zaznamenáváme-li počet buněk po naočkování do tekuté půdy v čase, získáme typickou růstovou křivku, z níž jsou zřejmé fáze množení. Po naočkování se buňky adaptují na nové podmínky a metabolizmus se z klidové fáze přepíná na aktivní. Tato fáze, kdy buněk nepřibývá, je lag fáze. Pomalu a nesynchronně se buňky začínají dělit, křivka se ohýbá a přechází do fáze vyrovnaného růstu s konstantní maximální rychlostí množení, kdy se všechny buňky dělí stejným tempem a bílkoviny i nukleové kyseliny se syntetizují stejnou rychlostí. Počet buněk roste exponenciálně, proto se tento interval označuje jako exponenciální fáze (obr. 2.10). Lineární průběh je zřejmý po vynesení logaritmu počtu buněk v čase (odtud někdy používané označení logaritmická fáze). Rychlost množení se pozvolna snižuje a po fázi zpomalení se populace dostává do stacionární fáze, kdy buněk nepřibývá, ani neubývá. Po další době začne živých buněk ubývat a populace je ve fázi hynutí. Proč kultura přechází do stacionární fáze, když prokazatelně nejsou vyčerpány živiny, není zcela vysvětleno (jistě mohou být vyčerpány limitní živiny a nahromaďují se toxické metabolity).

Obr. 2.10 Základní fáze růstové křivky bakterií

V optimální tekuté půdě (živném bujonu) se za 18 hodin namnoží modelová bakterie E. coli při teplotě 35 °C do koncentrace 10^9 buněk/ml. Při pohledu je původně čirá kultivační půda ve zkumavce mléčně zakalená, je slabě průsvitná a neprůhledná. Takto rostou nepříliš náročné střevní bakterie, pseudomonády, stafylokoky.

2.3.2Růst na pevné půdě

Bakterie se pěstují na živných půdách v kulatých skleněných nebo plastových miskách. Rostou v kupkách, kterým se výstižně říká kolonie, neboť osídlují určité území.

Zpočátku se bakterie pěstovaly v přirozených tekutých půdách i v těch umělých, jako je masový bujon, ovšem nebylo možno od sebe oddělit bakterie různých druhů. To umožnily až agarové půdy. Jednotlivé druhy bakterií rostou v oddělených koloniích, a lze je tak získat v čisté kultuře.

Kolonie bakterií mají rozmanitou velikost, tvar, konzistenci, zbarvení, mají lesklý nebo hrubý povrch, různě se ohraničují od podložky, na níž rostou. Kolonie některých bakterií jsou typicky zbarveny pigmentem, u jiných barvivo difunduje také do půdy a zabarvuje ji, některé fluoreskují nebo svítí (obr. P3, P4).

Bakterie z domény lékařské mikrobiologie vyrůstají převážnou většinou za 18 až 48 hodin v koloniích. Mladé kolonie jsou konvexní útvary, hladkého či drsného povrchu, většinou pravidelného tvaru. Kolonie aktinomycet, klostridií a bacilů tvoří bizarní rozvětvené útvary složené ze sektorů nepravidelné struktury s laločnatými okraji (obr. 2.11). Tak dorůstají i kolonie, které za 24 hodin byly zcela pravidelné.

Obr. 2.11 Stromovitá struktura vyvinuté kolonie Bacillus pumilus po 7 dnech

Kolonie modelové bakterie Escherichia coli jsou po 24 hodinách za optimálních laboratorních podmínek pravidelné, okraj je tvořen různě dlouhými buňkami, často v tenkých provazcích (obr. P5). Po několikadenní kultivaci, také vlivem lokálního vyčerpání živin, mají i kolonie Escherichia coli a ostatních gramnegativních tyček rozsochatou strukturu, jako je pravidlem u bacilů. Pravidelný okrouhlý tvar kolonie je více méně artefaktem krátké kultivace v nadbytku živin, který se bakteriím nabízí v laboratoři (obr. 2.12, P6).

Obr. 2.12 Kolonie Streptococcus mitis, která má na okraji dceřiné kolonie, z nichž se pak šíří do okolí opět pomocí dceřiných kolonií. Tento způsob není běžný

Růst kolonie

Množením buněk se populace prostorově zhušťuje a buňky na okraji se vytlačují do volné plochy. Pohyblivé bakterie putují po agarové půdě z periferie a plazivým růstem se šíří koncentricky ve vlnách. Například bakterie rodu Proteus přerůstají všechny bakterie izolované ze vzorku od pacienta, a proto je nutno jeho šíření po agaru zabránit. Dociluje se toho jednoduše použitím kultivační půdy s vyšším obsahem agaru. Taková půda je tužší a ostatní bakterie lze pak dobře izolovat.

2.4Biofilm

Biofilm je společenství mikrobiálních buněk nevratně přichycených k podložce nebo k okolním buňkám, usazeným v polymerní mimobuněčné hmotě, kterou samy produkují, jež mají změněný fenotyp (růstové vlastnosti). Biofilmem není povlak bakterií nebo plochá kolonie, pokud nemají tyto bakterie změněný fenotyp.

2.4.1Vznik a složení biofilmu

Volně plovoucí planktonické buňky se přichycují na pevný povrch pomocí adhezinů. Po přichycení změní své chování a fenotyp. Produkují velké množství lepivého polysacharidu podobného škrobu (obr. P7). Vytváří se z něj hlenová matrice, která drží buňky pohromadě a funguje jako voštinové lešení (obr. 2.13), v němž se buňky množí, tvoří se mikrokolonie a spleť kanálků (obr. 2.14, 2.15). Z biofilmu se ale na určitý impulz také buňky odlučují, přecházejí do planktonického stavu, odplouvají a kolonizují další části povrchu.

Obr. 2.13 Systém kanálků v biofilmu

Obr. 2.14 Mikroskopický řez biofilmem. Kanálkem v hmotě biofilmu proudí tekutina s rozpuštěnými živinami

Obr. 2.15 Voštinová struktura polymerní matrice biofilmu nesoucí uvnitř stafylokoky. Tenká vlákna polysacharidu glykokalyxu lepí buňky k sobě navzájem a ke stěnám voštinového lešení

Biofilm lze zobrazovat konfokálním laserovým mikroskopem v optických řezech a z nich složit prostorovou strukturu. Lze pořídit i animovaný záznam dějů v biofilmu.

Podle dostupnosti živin kolísá tloušťka biofilmu od několika µ do stovky µ. Biofilm není homogenní, skládá se ze shluků buněk a četných dutin propojených kanálky. Bakterie v něm rostou v mikrokoloniích. Polymerní matrice vytváří voštinovou strukturu, v níž jsou buňky přichyceny. Zhruba šestistěnné komůrky voštiny mají stěnu tlustou 150 nm.

2.4.2Biofilm a medicína

Tvorba biofilmu a zejména změna vlastností buněk má pro patogenezi některých infekčních onemocnění rozhodující význam. Nejdéle známý biofilm v lidském těle je povlak na zubní sklovině – zubní plak. Je fyziologický, vzniká přirozeně. Lze ho sice odstranit, ale vždy se tvoří znovu. Biofilmem kolonizují sliznice nepatogenní i patogenní bakterie.

Biofilm hraje významnou roli v infekcích, kdy se patogenní bakterie usadí na sliznici nebo uvnitř tkáně. Typickým případem je bakteriální endokarditida, srdeční zánět. Na chlopních se vytváří biofilm a za účasti fibrinu vzniknou vegetace. Endokarditida je způsobena převážně koky – streptokoky různého druhu, nebo stafylokoky. Toto onemocnění se velmi těžko léčí. Respirační choroba cystická fibróza je genetické onemocnění, při němž jsou pozměněny poměry v dolních cestách dýchacích. K primárním respiračním infekcím se přidávají chronické nebo opakující se infekce. Mají za následek ucpávání průdušek a trvalé poškození jejich epitelu. Na poškozeném terénu se později biofilmem usadí Pseudomonas aeruginosa a jemu podobné druhy. Biofilm se vyskytuje i při chronickém zánětu prostaty. Bakterie pronikají do prostaty proti proudu moči, z akutní prostatitidy se vyvine chronická, kterou biofilm zprvu jen komplikuje, později je i její příčinou.

Častá jsou infekční onemocnění v dutině ústní. Při periodontitidě vzniká v kapsách pod dásní polymikrobní biofilm, do něhož neproniká kyslík. Nahromaděná bakteriální hmota, odumřelé buňky tkáně a hnisavé buňky situaci zhoršují, neboť redukující prostředí napomáhá pomnožení anaerobních bakterií. Biofilm se vytváří také na špatně vyživované kůži a podkoží při bércových vředech a účastní se tak bludného kruhu – chabého krevního zásobení, nekrózy a působení bakterií. Biofilm se vytváří i na povrchu popálených ploch. Systematické chirurgické ošetřování eliminuje nebezpečí z tvorby biofilmu a ohrožení života jen kvůli infekci popálenin je minimalizováno.

Vážení čtenáři, právě jste dočetli ukázku z knihy Mikrobiologie.
Pokud se Vám líbila, celou knihu si můžete zakoupit v našem e-shopu.