Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy
Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována ani šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.

MUDr. Pavel Klener jr., Ph.D., prof. MUDr. Pavel Klener, DrSc.

Principy systémové protinádorové léčby

TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE:

Recenzenti:
Prof. MUDr. Bohuslav Melichar, Ph.D.
Prof. RNDr. Blanka Říhová, DrSc.

Vydání odborné knihy schválila Vědecká redakce nakladatelství Grada Publishing, a.s.

© Grada Publishing, a.s., 2013
Cover Design © Grada Publishing, a.s., 2013

Vydala Grada Publishing, a.s.
U Průhonu 22, 170 00  Praha 7
tel.: +420 234 264 401, fax: +420 234 264 400
www.grada.cz
jako svou 5345. publikaci

Odpovědná redaktorka Mgr. Jitka Straková
Sazba a zlom Antonín Plicka
Obrázky připravili MUDr. Pavel Klener jr., Ph.D. a Antonín Plicka.
Počet stran 200
1. vydání, Praha 2013

Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a.s.

Autoři a nakladatelství děkují společnostem Roche s.r.o., Merck Sharp & Dohme s.r.o.,
Boehringer Ingelheim, spol. s r.o., Bristol-Myers Squibb spol. s r.o., Dialog Jessenius o.p.s., Bayer s.r.o.,
Egis Praha spol. s r.o., Novartis s.r.o., Česká asociace farmaceutických firem za podporu,
která umožnila vydání publikace.

Publikace byla podpořena granty PRVOUK P24/LF1/3, PRVOUK P27/LF1/1, SVV-2013-266509,
UNCE 204021, IGA MZ NT/13072-4.

Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno.

Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky.

ISBN 978-80-247-4171-0

ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE:

E-knihu ve formátu EPUB vytvořil Antonín Plicka

ISBN 978-80-247-8842-5 (ve formátu PDF)
ISBN 978-80-247-8843-2 (ve formátu EPUB)

Předmluva

Předkládaná monografie navazuje na dřívější publikaci Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii (vydanou nakladatelstvím Grada Publishing v roce 2010), ale liší se svým zaměřením. Je orientována především na mechanismy účinku protinádorových léčiv v kontextu nových poznatků molekulární biologie. Používaná a nově zaváděná léčiva jsou zde sice zmiňována, ale bez bližších charakteristik jejich terapeutického využití, pouze s připomínkou hlavních indikací.

Do textu jsme zařadili několik „boxů“ přinášejících doplňkové údaje. Literární odkazy jsme omezili pouze na přehledová sdělení nebo zásadní publikace v renomovaných časopisech, které jsou zárukou validních informací.

Autoři děkují oběma recenzentům prof. RNDr. Blance Říhové, DrSc., z AV ČR a prof. MUDr. Bohuslavu Melicharovi z Univerzity Palackého v Olomouci za péči, kterou věnovali čtení rukopisu, a za cenné připomínky. Náš dík patří také pracovníkům nakladatelství Grada Publishing za vysoce profesionální redakční a technické zpracování publikace.

Praha, říjen 2013

autoři

1Úvod do problematiky nádorových onemocnění a protinádorové léčby

Zhoubná nádorová onemocnění představují závažný celospolečenský problém. Ačkoliv paleoonkologické studie přinášejí svědectví o výskytu zhoubných nádorů již v době prehistorické, teprve v minulém století se nádorová onemocnění dostala do popředí zájmu. Medicína se dříve logicky soustřeďovala na léčbu nejrůznějších závažných a smrtících onemocnění, zejména infekcí, a tak se léčba nádorových onemocnění nacházela mimo hlavní zájem lékařů. Jedinou protinádorovou léčebnou metodou zůstávala až do dvacátých let 20. století léčba chirurgická, byť její možnosti byly značně omezené.

Zcela nový způsob protinádorové terapie představoval objev a využití rentgenových paprsků. Jak chirurgická léčba, tak radioterapie se postupně zdokonalovaly. Pokroky v operační technice a anesteziologii umožňovaly stále odvážnější a radikálnější výkony, zlepšovala se i ozařovací technika, postupně se zaváděly nové zdroje ionizujícího záření s větší účinností na nádor a s menším rizikem poškození normálních tkání, postupně se zdokonalovaly též metody plánování radioterapie.

Teprve ve čtyřicátých letech minulého století lze pozorovat nesmělé začátky uplatnění nového léčebného přístupu, tj. chemoterapie. Byl to objev alkylačních látek (dusíkatý yperit) a později antimetabolitů (metotrexát). Z původně doplňkové metody se chemoterapie v průběhu šedesátých let 20. století stala jednou z hlavních léčebných metod. Na rozdíl od dosavadních čistě lokoregionálních metod umožňovala chemoterapie systémový léčebný účinek.

Od sedmdesátých let 20. století se začalo ve větší míře uvažovat též o posílení protinádorové imunity v protinádorové léčbě. Objevila se další léčebná disciplína – imunoterapie, nebo v širším smyslu tzv. biomodulační léčba.

Začaly se zveřejňovat i první příznivé zkušenosti se vzájemnou kombinací různých metod protinádorové léčby. Ukázalo se, že tzv. multimodální léčba má podstatně větší efektivitu než samostatně aplikované jednotlivé metody. Za mimořádný přínos lze považovat také postupné zdokonalování podpůrné a doplňkové léčby, která významně omezuje nebo i zcela eliminuje nežádoucí účinky, jež aplikaci všech metod protinádorové léčby provázejí, což vedlo ke snížení mortality.

Pokroky molekulární biologie a genetiky vedly ke stále hlubšímu poznání mechanismů kancerogeneze a patofyziologie nádorových onemocnění. S ohledem na tyto poznatky byly izolovány či syntetizovány chemické sloučeniny, které cíleně blokují nitrobuněčné pochody aberantně aktivované u nádorových buněk. Vznikla další nová disciplína – cílená terapie, jež se stala významnou součástí komplexní protinádorové léčby.

Dále se ukázalo, že růst nádoru není pouze výsledkem autonomní a neregulované proliferace, ale že velmi významným faktorem je též inhibice programované smrti buněk – apoptózy, která u některých typů nádorových onemocnění hraje dokonce významnější úlohu než vystupňovaná proliferace. Pro růst a šíření nádoru má mimořádný význam též indukce novotvorby cév – angiogeneze a vaskulogeneze, schopnost vytvářet aberantní vztahy s nenádorovými buňkami nádorového mikroprostředí a schopnost invazivního růstu a/nebo vytváření vzdálených metastáz. Protinádorové látky ovlivňující mikroprostředí se tak staly dalším obohacením léčebných možností.

Na nádor se přestalo pohlížet jako na masu homogenních nádorových buněk, které lze studovat a léčit per se, a pozvolna se začal prosazovat náhled na tumor jako na vysoce komplexní onemocnění, které je v jasném vztahu (vztazích) k „nenádorovým“ složkám mikroprostředí (obr. 1). Ukázalo se, že vlastní nádor je značně heterogenní soubor buněk. Později došlo k objevu tzv. nádorových kmenových buněk, které jsou jako jediné z celé nádorové tkáně nositeli nekonečné sebeobnovy (a tedy nesmrtelnosti) nádoru. Tato poznání vedla ke hledání nových možných přístupů protinádorové léčby.

Rozluštění lidského genomu a zdokonalování technologických postupů v oblasti genetiky, molekulární biologie a makromolekulární chemie vedly ke vzniku biologické terapie, založené na podávání strukturálních analog přirozených makromolekul, nejčastěji proteinů (např. monoklonálních protilátek či rekombinantních lidských proteinů). Rozvoj genové terapie, nanotechnologie a dalších disciplín otevírají další, zcela nové logistické, technologické a metodologické možnosti protinádorových strategií.

Obr. 1 Redukcionistický vs. komplexní pohled na nádor

NB – nádorová buňka, ECM – extracelulární matrix, F – fibroblast, M – makrofág, DB – dendritická buňka, L – lymfocyt, C – céva

V předkládané monografii se budeme zabývat pouze metodami, které mají systémový účinek a do různé míry ovlivňují velmi komplexní pochody kancerogeneze a patobiologie nádorových onemocnění. Zatímco konvenční chemoterapií lze ovlivnit především proliferaci, replikaci a apoptózu nádorových buněk, cílená terapie může více či méně selektivně zasáhnout i do dalších deregulovaných procesů, jako je invazivita, metastazování, angiogeneze, sebeobnova, diferenciace aj.

1.1Nádorová tkáň a nádorové mikroprostředí

Na nádor se až do nedávné minulosti pohlíželo jako na seskupení víceméně homogenních maligních buněk. Teprve poznatky posledních dvou dekád vedly k zásadní změně nazírání na maligní choroby, které se začaly zkoumat jako svého druhu „deregulované tkáně či orgány“, to znamená ve vztahu k nádorovému mikroprostředí.

Zatímco parenchym nádoru je tvořen samotnými nádorovými buňkami, nádorové stroma se skládá jednak z „nenádorových“ buněčných komponent, jednak z nebuněčných součástí. Je třeba zdůraznit, že nádorové stroma se může na složení nádoru podílet značně rozdílným způsobem. Zatímco difuzní velkobuněčný lymfom se obvykle skládá z výrazné převahy parenchymu (tj. lymfomových buněk), u Hodgkinova lymfomu mohou vlastní nádorové buňky (RS buňky) tvořit i méně než 1 % nádorové masy. A podobně – zatímco u chronické myeloidní leukemie jednoznačně převažuje podíl nádorového parenchymu (tj. masivní infiltrace kostní dřeně leukemickým klonem), v patogenezi primární myelofibrózy hraje hlavní roli deregulace nádorového stromatu (fibrotizace mikroprostředí kostní dřeně). Analogicky jako u časové osy kancerogeneze i v případě prostorového ohraničení bývá proto velmi obtížné určit přesné hranice nádoru ve smyslu „nádorového orgánu“, tedy vymezení, kde končí tkáň nádorová a kde začíná tkáň „zdravá“.

Mezi „nenádorové“ buněčné komponenty nádorového mikroprostředí patří například s nádorem asociované fibroblasty (cancer-associated fibroblasts – CAF), mezenchymové kmenové buňky (mesenchymal stem cells – MSC), endotelové buňky, pericyty a hladké svalové buňky cév, adipocyty nebo buňky imunitního systému: nádor infiltrující T-lymfocyty (tumor-infiltrating lymphocytes – TIL) či s nádorem asociované makrofágy (tumor-associated macrophages – TAM). Nebuněčné komponenty nádorového mikroprostředí jsou tvořeny zejména extracelulární matrix (ECM) a v ní impregnovanými cytokiny, růstovými a angiogenními faktory a dalšími bioaktivními molekulami produkovanými a sekretovanými nádorovými a nenádorovými buňkami mikroprostředí. Nádorové buňky, nenádorové buněčné složky a extracelulární matrix pak vytvářejí vlastní „tumor“ – deregulovaný orgán, v němž jednotlivé komponenty nádorového mikroprostředí vstupují do vzájemných komplexních vztahů. Navíc zdaleka neplatí, že pouze nádorové buňky představují patologickou komponentu nádorové tkáně. Bylo prokázáno, že téměř všechny „nenádorové“ buněčné komponenty bývají menší či větší měrou deregulované, a v důsledku toho více či méně podporují, umožňují, či dokonce indukují přežití, růst a šíření nádorového parenchymu (tj. vlastních nádorových buněk).

Příkladem může být splenický lymfom, u kterého „prosté“ odstranění sleziny (splenektomie) vede v řadě případů k navození kompletní remise, tj. k vymizení lymfomových buněk z ostatních kompartmentů (z kostní dřeně, periferní krve, event. infiltrovaných uzlin).

Každý, kdo se v laboratorních podmínkách pokoušel vytvořit buněčnou linii z primárních nádorových buněk, ví, že nádorové buňky in vitro velmi špatně proliferují a dříve či později odumřou či diferencují. Nádorové buňky, které často nelze eradikovat v organismu ani agresivní kombinovanou chemoimunoradioterapií, odumírají spontánně v okamžiku, kdy jsou odstřiženy od komplexních podpůrných stimulů nádorového mikroprostředí. Tento fakt jednak potvrzuje nezastupitelnou úlohu mikroprostředí, jednak v sobě skrývá obrovský potenciál molekulárních cílů, proti nimž lze teoreticky zasáhnout v rámci experimentální terapie nádoru za účelem co největšího ochromení aberantních vztahů mezi nádorovým parenchymem a stromatem. Stroma karcinomu prsu je např. bohaté na fibroblasty a makrofágy, zatímco stroma normální prsní tkáně je na tyto buněčné typy chudé a obsahuje zejména adipocyty. S karcinomem asociované fibroblasty produkují SDF1 (stroma-derived factor 1), parakrinní růstový faktor a chemoatraktant pro nádorové buňky, které na svém povrchu exprimují receptor CXCR4/CD184. S nádorem asociované fibroblasty bývají ve srovnání s „normálními“ fibroblasty aktivované (tzv. myofibroblasty), čímž se podobají aktivovaným fibroblastům v místě hojící se rány. Proto se z patofyziologického hlediska tumory někdy označovaly jako „rány, které se nikdy nezhojí“.

Buňky imunitního systému velmi často místo toho, aby nádor eliminovaly, podporují jeho růst a invazivitu sekrecí prozánětlivých či proangiogenních faktorů (např. TNF-α, GM-SCF, CSF1, IL4, IL6, SCF, VEGF, PDGF, MMP) nebo inhibují protinádorovou složku imunity produkcí imunosupresivních molekul (např. IL10, TGF-β, indolamin-2,3-dioxygenázy – IDO). Nádorové buňky mohou např. atrahovat makrofágy v důsledku sekrece klíčového růstového faktoru monocytů CSF1 (colony-stimulating factor 1). Aktivované makrofágy (TAM – tumor-associated macrophages) pak působí mutagenně, neboť v místě rostoucího nádoru produkují vysoké množství kyslíkových radikálů (reactive oxygen species – ROS). Kyslíkové radikály navíc účinně inhibují signalizaci z T-buněčného receptoru v důsledku snížení exprese TCR-zeta řetězce. Makrofágy navíc produkují celou řadu cytokinů a růstových faktorů, které stimulují růst a proliferaci nádorových a nenádorových buněk mikroprostředí (FGF, EGF, PDGF, HGF aj.). Bylo prokázáno, že bazofilní polymorfonukleáry stimulují růst CML blastů produkcí růstového faktoru HGF.

Hlavní populace imunosupresivních leukocytů, které klíčovým způsobem interferují s protinádorovou imunitou, zahrnují regulační T-lymfocyty (regulatory T-cells – Tregs) a myeloidní supresorové buňky (myeloid-derived suppressor cells – MDSCs). Regulační T-lymfocyty (CD4+, CD25+, FOXP3+) inhibují nádor infiltrující cytotoxické T-lymfocyty (CD8+) jednak humorálně – produkcí imunosupresivních cytokinů (IL10, TGF-β), jednak kontaktně – expresí inhibičních molekul (CTLA4, PD-L1). Myeloidní supresorové buňky sekretují imunosupresivní molekuly, indukují populaci regulačních T-lymfocytů a přímo blokují funkci T-buněčných receptorů na nádor infiltrujících T-lymfocytech.

Komplexně deregulované jsou i nádorem indukované novotvořené cévy (podrobně viz kap. 11.1.2). Stejně tak i složení extracelulární matrix nádorů, vytvářející jednak mezibuněčnou výplň stromatu, jednak bazální membrány oddělující epiteliální a endoteliální buňky od stromatu, vykazuje značné odchylky v porovnání se zdravými tkáněmi. Stroma solidních nádorů bývá výrazně tužší ve srovnání se zdravou tkání, za což je odpovědná např. zvýšená depozice kolagenu, změněná struktura kolagenních vláken a/nebo zvýšená aktivita lysyl-oxidázy (která vytváří zkřížené vazby mezi jednotlivými kolagenními vlákny).

Složení bazálních membrán epiteliálních karcinomů je také výrazně odlišné v porovnání se zdravými tkáněmi. Vzhledem k tomu, že složení bazálních membrán je odpovědné za řadu klíčových dějů, včetně ukotvení epiteliálních buněk na stroma, signalizaci do nitra buněk přes integrinové receptory či udržování polarity epitelu, má změna složení bazálních membrán komplexní dopad na celou řadu buněčných funkcí včetně ztráty polarity, zvýšení migračních a lokomočních schopností až postupnou přeměnu z epiteliálního do mezenchymálního fenotypu (epithelial to mesenchymal transition – EMT). Změna složení ECM nádorového stromatu vede též ke komplexní změně v distribuci cytokinů a růstových faktorů impregnovaných v matrici.

Odhalení, že nádory nejsou tvořeny pouze nádorovými buňkami, v sobě skrývá zásadní dopad na koncipování nových přístupů protinádorové terapie, která může být zaměřena kromě samotných nádorových buněk též na „nenádorové“ komponenty. Příkladem v praxi používané protinádorové terapie zaměřené proti „nenádorovým“ komponentám nádorového mikroprostředí může být antiangiogenní terapie (např. bevacizumab), imunomodulační monoklonální protilátky (anti-CTLA4, ipilimumab, anti-PD-1) nebo tzv. imunomodulační látky (IMID) – thalidomid, lenalidomid.

1.2Nádorové kmenové buňky a jejich hnízdo (niche)

Tkáňově specifické kmenové buňky (hematopoetické, jaterní, neuronální, kožní atd.) mají dvě vlastnosti, které je zásadním způsobem odlišují od ostatních buněk dané tkáně. Je to pluripotence a schopnost nekonečné sebeobnovy (tj. nesmrtelnost, imortalita). Schopnost nekonečné sebeobnovy teoreticky umožňuje vysokou pravděpodobnost vzniku mutací a zároveň akumulaci různých mutací v témže buněčném klonu během života jednotlivce. Nesmrtelnost představuje i jednu z hlavních charakteristik nádorových kmenových buněk.

Paradigma nádorových kmenových buněk předpokládá, že k maligní transformaci dochází na úrovni normálních, tkáňově specifických kmenových buněk, jak je znázorněno na obrázku 2. Nádorové kmenové buňky jsou zodpovědné za udržení malignity v organismu pacienta. Jejich asymetrickým dělením vznikají kromě dceřiných kmenových buněk také více či méně diferencované nádorové buňky, jejichž schopnost sebeobnovy je omezená a citlivost vůči terapii často vyšší v důsledku zvýšené mitotické aktivity a ztráty některých vlastností typických pro kmenové buňky (vyšší exprese anti-apoptotických molekul, efluxních kanálů či reparačních enzymů DNA aj.). Přežití nádorových kmenových buněk je zodpovědné za návrat choroby po jinak „úspěšné“ léčbě, kdy je dosaženo kompletní remise onemocnění (podle standardních vyšetřovacích algoritmů, tedy zejména pomocí CT či PET-CT kritérií).

Obr. 2 Normální a nádorová buněčná populace – vznik nádorových kmenových buněk maligní transformací normálních fyziologických protějšků a časných progenitorů

Výzkum nádorových kmenových buněk dosáhl nejhlubších poznatků v hematoonkologii. Leukemická kmenová buňka vzniká z normální hematopoetické kmenové buňky ziskem minimálně dvou komplementárních mutací (obr. 3). Velmi zjednodušeně lze konstatovat, že se jedná o mutaci, která zablokuje diferenciaci, a mutaci, která stimuluje proliferaci leukemických buněk. Leukemická populace je minimálně zpočátku onemocnění monoklonální (či maximálně oligoklonální), na rozdíl od silně polyklonální normální krvetvorby. Leukemická krvetvorba napodobuje normální krvetvorbu v tom, že je vertikálně hierarchizovaná. Na vrcholu pyramidy leukemické populace stojí nesmrtelné leukemické kmenové buňky (cca 1 : 10 000 až 1 : 1 000 000 leukemických buněk), které jako jediné jsou schopné udržovat nesmrtelný fenotyp tohoto maligního onemocnění. Leukemické kmenové buňky akutních myeloidních leukemií jsou charakterizovány specifickým imunofenotypem CD34+ CD38– CD90+ CD45RA–. Zbytek leukemické populace tvoří maligní buňky na různé úrovni diferenciace (leukemické blasty). Stupeň diferenciačního bloku leukemických blastů je v přímé závislosti na typu mutovaného hematopoetického transkripčního faktoru.

Obr. 3 Zjednodušené schéma leukemogeneze za účasti dvou komplementárních mutací

CML – chronická myeloidní leukemie, PV – polycythaemia vera, ET – esenciální trombocytemie, PMF – primární myelofibróza, AML – akutní myeloidní leukemie, MDS – myelodysplastický syndrom, MPN – myeloproliferativní neoplazmata, CMML – chronická myelomonocytární leukemie, RARS-T – refrakterní anemie s prstenčitými sideroblasty s trombocytemií, RCUD – refrakterní cytopenie s unilineární dysplazií, RCMD – refrakterní cytopenie s multilineární dysplazií, RAEB – refrakterní anemie s excesem blastů

Leukemické blasty na rozdíl od leukemických kmenových buněk nejsou nesmrtelné (nemají schopnost nekonečné sebeobnovy, nekonečný klonogenní potenciál), ačkoliv mívají vystupňovanou mitotickou aktivitu. Leukemické blasty tudíž po určitém počtu dělení zákonitě podléhají procesu stárnutí, apoptózy, nekrózy, autofagie či jiné buněčné smrti.

Cílená eradikace populace leukemických kmenových buněk by teoreticky vedla ke spontánnímu odumření „zbytkové“ leukemické populace. To má zásadní dopad na vývoj nových anti-leukemických terapeutických strategií.

Kromě leukemie byly nádorové kmenové buňky odhaleny u celé řady solidních nádorů, jako je karcinom prsu, kolorektální karcinom, nádory CNS apod. Ačkoliv jejich morfologická identifikace bývá obvykle nemožná, byly odhaleny některé biochemické a povrchové markery preferenčně nacházené v populaci kmenových buněk určitých typů nádorových onemocnění. Markery kmenových buněk jsou uvedeny v tabulce 1.

Tab. 1 Markery kmenových buněk

Nádorové onemocnění

Marker

karcinom prsu

CD44+ CD24– Lin– ALDH1+

nádory CNS

CD133+

maligní melanom

CD20+ ABCB5+

kolorektální karcinom

CD133+ CD44+ ALDH1+ EpCAM+

karcinom plic

CD24+ CD44+ CD133+

nádory hlavy a krku

CD44+ CD44+ CD133+ CD28+ CD29+

karcinom jater

CD133+ CD90+ CD44+

karcinom pankreatu

CD44+ CD24+ CD133+ a ESA+

sarkomy

CD44+ CD105+ Stro1+

ALDH1 – aldehyde dehydrogenase 1, Lin – lineage, ESA – epithelial specific antigen, Stro1 – stromal marker 1

Pro nádorové kmenové buňky platí analogie toho, co bylo řečeno o leukemických kmenových buňkách. Nádorové kmenové buňky vznikají transformací svých fyziologických protějšků, tedy normálních, tkáňově specifických kmenových buněk. V porovnání s diferencujícími či diferencovanými nádorovými buňkami vykazují zvýšenou schopnost opravy DNA a obvykle se nacházejí v klidovém stavu (v G_0 fázi). Obě tyto vlastnosti vedou k vysoké rezistenci nádorových kmenových buněk vůči chemoterapii a radioterapii. Nádorové kmenové buňky jsou tedy nesmrtelné (mají schopnost nekonečné sebeobnovy), ale obvykle vykazují velmi nízkou mitotickou aktivitu. Naopak zbytková nádorová populace může mít vystupňovanou mitotickou aktivitu, schopnost nekonečné sebeobnovy však postrádá. Přežití nádorových kmenových buněk je nejčastější příčinou návratu (relapsu) maligního onemocnění po léčbě.

Normální kmenové buňky přežívají díky signálům mnoha podpůrných buněk, které vytvářejí specifickou topografickou tkáňovou jednotku složenou z kmenových buněk, podpůrných buněk a extracelulární matrix – tzv. hnízdo kmenových buněk (stem cell niche, z franc. niche [niš] – hnízdo). Normální struktura zdravé tkáně vytváří podmínky pro existenci relativně malého počtu hnízd s přísně regulovaným počtem kmenových buněk. V hnízdě jsou kmenové buňky v důsledku exprese specifických povrchových molekul a příslušných receptorů topograficky soustředěny pouze do určitých míst, obvykle v pevné vazbě na podpůrné buňky, což umožňuje udržení polarity kmenových buněk, nezbytné pro jejich asymetrické dělení (z jedné kmenové buňky vznikají dvě dceřiné buňky, z nichž jedna vstupuje do diferenciace, zatímco druhá zůstává kmenovou buňkou). Na architektuře hnízda kmenových buněk se významně podílí též správné složení extracelulární matrix a bazálních membrán, které jsou odpovědné za optimální ukotvení kmenových buněk. Homeostáza kmenových buněk je regulována mimo jiné optimální tenzí kyslíku v hnízdě (tj. mírou hypoxie) a řadou parakrinně sekretovaných působků produkovaných podpůrnými buňkami.

Pro jeden typ kmenových buněk může existovat více typů hnízd. Například hematopoetická kmenová buňka přežívá minimálně ve dvou rozdílných hnízdech – jedná se o tzv. endosteální niche (s nízkou tenzí kyslíku, ve vazbě na osteoblasty) a tzv. perivaskulární niche (s vysokou tenzí kyslíku, ve vazbě na endoteliální buňky). Ukotvení krvetvorných kmenových buněk (hematopoetic stem cells – HSC) na podpůrné buňky (osteoblasty, endotelie) umožňuje udržení polarity HSC a je podkladem pro asymetrické dělení HSC.

Deregulace nádorového mikroprostředí (tj. „nenádorových“ buněčných komponent, ale též změny ve složení ECM či změny v tenzi kyslíku) mohou vytvářet permisivní hnízdo pro přežití, proliferaci a šíření nádorových kmenových buněk. Abnormální produkce proteáz (např. plazminu či MMP) vede postupně k remodelaci mikroprostředí včetně narušení bazálních membrán a buněčných interakcí (cell-cell interactions), které jsou nahrazeny interakcemi buňka-stroma (cell-stroma interactions), změněnou aktivací přes integrinové receptory a změněnou motilitou buněk. Vzniká hnízdo nádorových kmenových buněk.

1.3Nádor jako důsledek genetické a epigenetické deregulace

Vznik nádorového onemocnění je složitý vícestupňový proces, během něhož se normální buňka mění akumulací řady klíčových genetických a epigenetických mutací na buňku nádorovou.

Genetické mutace (bodové mutace, chromozomální translokace apod.) mění primární strukturu DNA (tj. kód daný sekvencí nukleových bází) konkrétních genů či mikroRNA (miR), což obvykle vede ke strukturálnímu a funkčnímu narušení příslušných proteinů (v případě mutace genů) nebo ke změněné expresi cílových proteinů (v případě mutace miR).

Epigenetické mutace vedou k narušení sekundární (epigenetické) struktury DNA. Epigenetická struktura DNA je dána posttranslační úpravou histonů a/nebo DNA, z chemického hlediska se nejčastěji jedná o acetylaci a metylaci (i když existují i jiné formy posttranslační úpravy, např. ubikvitinace, sumoylizace, citrulinace aj.). Vzhledem k tomu, že acetylace/deacetylace histonů hraje v sekundárním uspořádání DNA hlavní roli, hovoří se někdy o tzv. histonovém kódu (jako doplňku ke genetickému kódu danému sledem nukleových bází). Výsledkem je změna prostorového uspořádání DNA (z heterochromatinu na euchromatin či naopak) a s tím spojená změna exprese příslušných genů či miR.

U nádorových onemocnění může docházet k utlumení exprese klíčových transkripčních faktorů či tumor supresorových genů, nebo naopak k obnovení exprese genů či miR, které nejsou v dospělém organismu za normálních podmínek exprimovány (např. geny účastnící se procesu embryogeneze apod.). Bylo prokázáno, že u solidních nádorů dochází v průběhu kancerogeneze k nahromadění v průměru šesti až osmi kritických mutací. U hematologických malignit je situace mírně odlišná, u akutních leukemií je třeba zisk minimálně dvou kritických mutací. Neznamená to ovšem, že v leukemických či nádorových buňkách nalezneme pouze výše zmíněný počet mutací – leukemické a nádorové buňky vykazují v době diagnózy nádorového onemocnění obvykle stovky až tisíce různých genetických a epigenetických změn, nicméně většinu z nich tvoří tzv. sekundární mutace, které vznikají následkem zvýšené genetické nestability nádorových buněk a na procesu kancerogeneze se pravděpodobně aktivně nepodílejí. Pouze některé mutace představují tzv. kritické mutace, které jsou přímým podkladem maligní transformace nádorových buněk. Mezi kritické mutace patří např. aktivace onkogenů, inaktivace tumor supresorových genů, zvýšení exprese inhibitorů apoptózy, mutace genů řídících průchod buněčným cyklem apod.

V průběhu kancerogeneze postupně premaligní a později maligní klon kooptuje celou řadu nenádorových buněk mikroprostředí včetně buněk imunitního systému, které následně usnadňují přežití, růst a šíření nádoru v organismu a metastazování lymfatickou či krevní cestou. Plně maligní metastatický kolorektální karcinom nevznikne během dnů či týdnů, ale ke kumulaci kritických mutací dochází obvykle v průběhu řady let. Přesně určit časový bod, kdy se ze zdravé sliznice tlustého střeva stává „nádor“, není možné. Poslední mezistupeň kancerogeneze, ze kterého je progrese do plně maligní formy již pouze otázkou času, označujeme jako prekancerózu (např. vilózní adenom jako prekanceróza kolorektálního karcinomu). U prekancerózy dosáhla deregulace homeostázy následkem akumulace kritických mutací již takového stupně, že samotný proces kancerogeneze už nelze zastavit. Schematicky je postupný vznik nádorového onemocnění znázorněn na obrázku 4.

Obr. 4 Schéma vícestupňového procesu kancerogeneze

Proces kancerogeneze je možno ještě zpomalit či zastavit jedině v jeho iniciálních etapách (iniciace a promoce) některými chemopreventivními přípravky. Nicméně již iniciace představuje nevratný proces počátečních genetických změn, v jejichž důsledku mohou iniciované buňky přežívat v morfologicky „zdravých“ tkáních celé roky. Iniciované buňky pak mohou být vystaveny promoci v souvislosti se setkáním s chemickými kancerogeny, ionizujícím zářením či s vlivem probíhajícího zánětlivého procesu. V průběhu promoce obvykle dochází k akcentaci buněčné proliferace a k potlačení apoptózy a oprav DNA, což usnadní vznik dalších genetických a epigenetických změn. V případě prekancerózy jde již o nevratné směřování do plně maligního fenotypu.

Plně maligní klon dává svým dělením vzniknout nádorové populaci, v níž od počátku probíhá klonální divergence vlivem různých selekčních tlaků. Selekční tlaky působí jednak zevnitř nádorové populace – genetickou nestabilitou nádorových buněk a z ní plynoucí akumulací genetických mutací (agresivnější klony tak postupně vytlačují původní nádorový klon), jednak zvnějšku – například vlivem protinádorové imunity či účinkem protinádorové terapie (klony rezistentní k léčbě postupně přerůstají původně citlivé nádorové buňky).

Nádorové onemocnění má tudíž v naprosté většině případů tendenci k postupnému zvyšování agresivity. Proto hlavní léčebnou strategií u většiny malignit zůstává co nečasnější eradikace maligního klonu. Kompletní eliminaci nádorových buněk však obvykle komplikuje systémová diseminace či metastatický rozsev nádoru. Avšak i takové komplexní procesy, jako je novotvorba cév či tvorba vzdálených metastáz, představují vlastnosti, které nádorová buňka (či lépe nádorová tkáň) získává v průběhu progrese nádoru (nejedná se o vlastnosti, které by nádorové buňky měly od samého počátku).

1.4Nádor jako důsledek selhání imunologického dohledu

Možnou roli (selhání) imunitního systému při vzniku a šíření nádorů předpokládal již Paul Ehrlich v roce 1909, ale vědecká hypotéza imunologického dohledu nad nádory (cancer immune surveillance) byla postulována až v padesátých letech 20. století Burnettem a Thomasem. V dalších dekádách byl vliv imunitního systému na vývoj nádorových onemocnění postupně zpochybňován, renesance zájmu o imunitní systém ve vztahu ke vzniku a vývoji nádorů nastala až v devadesátých letech 20. století, kdy bylo experimentálně prokázáno (zejména pomocí myších knock-out modelů), že vyřazení klíčových hráčů či regulátorů vrozené či získané imunity (např. perforinu, IFN-γ, STAT1, RAG2 aj.) je asociováno se zvýšenou tvorbou spontánních či chemicky indukovaných nádorů. Dalším důkazem pak byla zvýšená incidence některých typů nádorových onemocnění u imunokompromitovaných pacientů, např. pacientů po orgánových transplantacích či pacientů s AIDS. Poslední dvě dekády intenzivního výzkumu v imunologii nicméně přinesly důkazy pro duální roli imunitního systému v průběhu kancerogeneze. Imunitní systém může na jedné straně přispívat k eliminaci nově transformovaných buněk nebo k eradikaci zbytkové nádorové populace po léčbě, na druhou stranu byla v mnoha případech jasně demonstrována podpůrná role imunitního systému při přežití, růstu či šíření celé řady nádorů.

Předpokládá se, že hlavní roli v protinádorové imunitě hrají cytotoxické T-lymfocyty. Alogenní transplantace kostní dřeně za použití T-depletovaných štěpů byly spojeny se signifikantně vyšším rizikem relapsu akutní myeloidní leukemie ve srovnání s transplantacemi za použití štěpů, které T-lymfocyty obsahovaly.

Základním dogmatem protinádorové imunity je existence nádorových antigenů. První důkazy o jejich existence byly podány v šedesátých letech minulého století, kdy bylo experimentálně prokázáno, že imunizace imunokompetentních myší chemicky indukovanými nádory chrání tyto myši před vznikem stejných typů (chemicky indukovaných) nádorů.

Následné zjištění, že nádory formované v imunokompetentních myších jsou kvalitativně odlišné (neimunogenní) ve srovnání se stejnými typy nádorů formovaných v imunodeficitních myších (imunogenní), vedlo k postulaci hypotézy tzv. editace nádoru imunitním systémem (cancer immunoediting). Tato hypotéza předpokládá tři vzájemně provázané fáze: eliminaci, ekvilibrium a únik nádoru (obr. 5). V první fázi tzv. eliminace dochází k aktivnímu ničení nádorových buněk složkami imunitního systému. V případě, že některé nádorové buňky uniknou imunologickému dohledu, dochází k posunu do druhé (různě dlouhé) fáze – tzv. ekvilibria (rovnováhy), kdy imunitní systém aktivně brání růstu a/nebo šíření nádoru, ale již není schopen nádorové buňky zcela eradikovat. Fáze ekvilibria byla experimentálně prokázána u myšek s chemicky indukovanými sarkomy, u kterých byla latence růstu makroskopických nádorů významně zkrácena podáním monoklonálních protilátek eliminujících myší T-lymfocyty (tedy vyřazením specifické imunity). Nádorové buňky izolované z následně formovaných tumorů byly navíc vysoce imunogenní, čímž připomínaly nádory vzniklé v imunodeficitních myškách. V případě selhání ekvilibria dochází k rozvoji třetí fáze – tzv. úniku nádorových buněk, a k na něj navazujícímu růstu a šíření nádoru v organismu. K úniku nádorových buněk před imunitním systémem může docházet rozličnými mechanismy, které však lze obecně rozdělit do dvou velkých skupin:

1. 1.mechanismy vycházející z nitra nádorových buněk neboli intrinzický únik („kamufláž“), kam patří např. ztráta exprese tumor specifických antigenů; ztráta exprese MHC gp I. třídy už znamená ztrátu molekul, které zajišťují prezentaci nádorového antigenu na povrchu nádorových buněk;

2. 2.mechanismy vycházející z mikroprostředí nádoru neboli extrinzický únik („sabotáž“), kam řadíme např. sekreci imunosupresivních cytokinů a molekul (IL10, TGF-β, VEGF, indolamin-2,3-dioxygenáza) či zmnožení populací imunosupresivních leukocytů (např. regulační T-lymfocyty – Tregs), myeloidních imunosupresivních buněk (MDSC), nezralých dendritických buněk (iDC) aj. (viz dále kap. 7 Imunoterapie).

Pochopení významu imunitního systému pro přežití a růst nádoru se odrazilo v nových terapeutických přístupech v léčbě nádorů, ať už se jedná o aplikaci monoklonálních protilátek proti nádorovým antigenům (CD20 u B-lymfomů, HER2 u karcinomu prsu), adoptivní transfer tumor specifických cytotoxických T-lymfocytů (expandovaných in vitro, případně geneticky modifikovaných), aktivní imunizaci pomocí nádorových vakcín, či o modulaci nádorového mikroprostředí (např. monoklonální protilátky proti CTLA-4 či PD-1).

Obr. 5 Imunologický dohled nad nádory a mechanismy jeho selhání – immune escape (volně podle Schreiber et al. Science, 2011; 331: 1565)

PD-L – programmed death (programová smrt), MDSC – myeloid-derived suppressor cells (myeloidní supresorové buňky), T-regs – regulatory T-cells (regulační T-lymfocyty), CTLA-4 – cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4, IDO – indolamin-2,3-dioxygenáza

1.5Nádor jako důsledek chronického zánětu či infekce

Zatímco akutní zánět vede k eliminaci patogenu a chrání organismus před poškozením včetně nádorové transformace (v případě celé řady virových infekcí), chronický zánět přispívá ke kancerogenezi na všech jejích úrovních. Podporuje iniciaci nádoru navozením chronického genotoxického stresu, podporuje promoci nádoru následkem stimulace buněčné proliferace a přispívá k progresi nádoru indukcí novotvorby cév a podporou migrace a invazivity. Chronický zánět (tj. imunitní složka nádoru podporující jeho vznik a následný růst) a imunologický dohled (tj. imunitní složka inhibující vznik, růst a šíření nádoru) mohou velmi pravděpodobně koexistovat i v rámci jedné konkrétní nádorové léze a vytvářet provázaný komplex vzájemně protichůdných vztahů.

1.5.1Fyziologické aspekty zánětlivé reakce

Již v roce 1863 dával Wirchow vznik nádorových onemocnění do souvislosti s probíhajícím zánětem. Na tomto místě je vhodné si stručně připomenout jednotlivé fáze zánětlivé odpovědi.

V návaznosti na poranění či infekci dochází ke komplexní odpovědi organismu, která má za cíl zhojení poškozené či infikované tkáně. Ta zahrnuje především lokální depozici fibrinové zátky a bolusu celé řady bioaktivních molekul následkem degranulace trombocytů, vystupňované koagulace a aktivace komplementu v místě poškozené tkáně či probíhající infekce (leukotrieny, C3a, C5a, trombin, serotonin, heparin, faktor V, fibrinogen, von Willebrandův faktor, PDGF, bFGF, TGF-α, TGF-β aj.). Následkem působení cytokinů a chemoatraktantů dochází k aktivaci žírných buněk a tkáňových makrofágů v místě poškození a k aktivaci a transmigraci leukocytů (neutrofilů, monocytů, eozinofilů) do místa poškození.

Aktivace žírných buněk – např. vazbou meziproduktů aktivace komplementu (C3a C5a) na specifické receptory – má za následek degranulaci histaminu, serinových proteáz, tryptázy, proangiogenních molekul (bFGF), MMP a dalších klíčových molekul v místě zánětu či infekce. Aktivace leukocytů zahrnuje aktivaci selektinů a integrinů, imobilizaci a následnou extravazaci leukocytů do místa zánětu. Vcestovalé neutrofily a makrofágy fagocytují bakterie a produkují kyslíkové a dusíkové radikály (reactive oxygen species – ROS, reactive nitrogen species – NOS), které mohou působit genotoxicky (mutagenně). Vcestovalé monocyty se mění v tkáňové makrofágy a jsou producenty mnoha klíčových cytokinů, včetně TNF-α, IL1, TGF-β, PDGF, bFGF, IGF-1 a IGF-2. Cytokiny produkované aktivovanými makrofágy mění vlastnosti dalších buněčných typů, včetně endotelových, mezenchymových či epitelových buněk a hlavní měrou ovlivňují výslednou remodelaci hojící se tkáně, včetně její neovaskularizace. Aktivace fibroblastů v místě zánětu vede k akcentaci sekrece extracelulární matrix, která vytváří stroma granulační tkáně. Aktivované fibroblasty následně působí kontraktilně a hlavní měrou se podílejí na uzavření rány a tvorbě jizvy. Posledním krokem při hojení rány je reepitelizace.

1.5.2Zánět a nádorová onemocnění

Předpokládá se, že až 15 % všech nádorových onemocnění vzniká v místě chronické infekce či zánětu. Delece či mutace TP53 lze detekovat s vysokou frekvencí u mnoha chronických zánětlivých chorob, jako je revmatoidní artritida či nespecifické záněty střeva. Kolorektální karcinom vzniká často v terénu nespecifických zánětů střev (ulecrózní kolitidy či Crohnovy nemoci), hepatocelulární karcinom vzniká na podkladě chronické hepatitidy B a C, karcinom močového měchýře u schistosomiázy a karcinom či lymfom žaludku na podkladě chronické gastritidy vyvolané Helicobacter pylori. Eradikace této bakterie, která je odpovědná za chronickou gastritidu, vede u časných stadií MALT lymfomu žaludku ke spontánní involuci lymfomu (následkem odstranění stimulačního efektu chronicky probíhajícího zánětu) bez nutnosti podávání systémové chemoterapie.

Další důkaz poukazující na význam zánětu v průběhu nádorové transformace pochází z epidemiologických metaanalýz pacientů dlouhodobě užívajících nesteroidní protizánětlivé léky (non-steroid anti-inflammatory drugs – NSAID). Prokázalo se, že dlouhodobé užívání NSAID snižuje pravděpodobnost vzniku některých nádorů až o 50 % (kolorektální karcinom, karcinom plic, karcinom žaludku).

Molekulární podstata stimulačního efektu probíhajícího zánětu na proces nádorové transformace či progrese je předmětem intenzivního zkoumání. Bylo prokázáno, že nádorové buňky produkují spektrum cytokinů, chemokinů a růstových faktorů, které působí chemotaxi a aktivaci leukocytů (lymfocytů, monocytů, neutrofilů, eozinofilů, žírných buněk) do místa nádoru. Aktivované makrofágy produkují širokou škálu proangiogenních a lymfangiogenních molekul a mohou působit imunosupresivně (např. produkcí IL10). Makrofágy také obvykle vylučují cytokiny, které parakrinně působí na nádorové buňky a pozitivně tím ovlivňují jejich přežití, proliferaci a migrační schopnosti (šíření nádoru). Například buňky melanomu mohou pod vlivem cytokinů a růstových faktorů produkovaných aktivovanými makrofágy sekretovat do okolí řadu biomolekul, včetně IL8 a VEGFA, čímž dochází k parakrinní stimulaci angiogeneze. Aktivní působky produkované aktivovanými makrofágy ovlivňují nejen nádorové buňky, ale také „nenádorové“ buněčné komponenty mikroprostředí, včetně endotelových buněk, mezenchymových kmenových buněk či T-lymfocytů. Postupně tak v nádorové tkáni dochází ke komplexní remodelaci nádorového stromatu, které se stává zvýšeně permisivní k dalšímu růstu a šíření nádoru. Nádorové stroma plně vyvinutého tumoru může dokonce samo o sobě působit jako induktor či promotor kancerogeneze a podporovat např. transformaci zbylých normálních tkáňových kmenových buněk na buňky nádorové. Uzavírá se bludný kruh komplexních patologických vztahů mezi nádorovými a nenádorovými buňkami.

1.6Lymfoproliferativní choroby jako důsledek deregulace specifické imunity

Lymfocyty (B-lymocyty a T-lymfocyty) jako jediné buňky v organismu exprimují na svém povrchu vysoce specifické povrchové receptory schopné vázat antigen – tzv. imunokompetentní receptory: B-buněčný receptor (BCR) a T-buněčný receptor (TCR). Díky tomu jsou lymfocyty nositeli a vykonavateli tzv. získané (adaptivní, specifické) imunity.

Vývoj lymfocytů je poměrně složitý, probíhá v kostní dřeni, primárních lymfatických orgánech – kostní dřeň, thymus, a sekundárních lymfatických orgánech – uzliny, slezina, tonzily, Peyerské pláty střeva a další slizniční lymfatická tkáň – MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) (obr. 6A, B).

V kostní dřeni dochází k vývoji pro-lymfocytu z krvetvorné kmenové buňky. V průběhu diferenciace lymfoidních progenitorů dochází postupně k vytvoření a následné povrchové expresi BCR a TCR receptorů. Je třeba si uvědomit, že jednotlivé receptory BCR (tj. imunoglobulinové receptory třídy IgM či IgD) a TCR nejsou kódovány jednotlivými geny, ale tzv. moduly označovanými V (variable), D (diversity) a J (joining). V-D-J úseky DNA podléhají během vývoje lymfocytu v kostní dřeni tzv. rekombinaci, kdy rozstřižením a následným spojením DNA pomocí enzymů RAG1 a RAG2 (recombinase activating genes) vznikají (zcela náhodně) různé výsledné molekuly povrchových imunoreceptorů (obr. 7). Vzhledem k tomu, že se jedná o náhodný proces, může při rekombinaci docházet k vytvoření takových molekul DNA, které nelze přepsat do výsledného proteinu (tzv. neproduktivní rekombinace). Na druhou stranu mohou vznikat takové imunokompetentní receptory, které silně vážou vlastní antigeny (tzv. autoreaktivní klony).

Aby nedocházelo k zahlcení organismu nereaktivními a/nebo autoreaktivními klony, musejí být takové klony eliminovány. Hlavní roli v tomto procesu hraje thymus. Vzhledem k tomu, že imunokompetentní receptory mají klíčový vliv na přežití lymfocytů, jsou nereaktivní klony s neproduktivní rekombinací BCR či TCR odsouzeny k apoptóze. Klony s příliš silnou afinitou k vlastním antigenům (autoreaktivní klony) jsou v thymu likvidovány (tzv. negativní selekce), a do organismu se tudíž dostávají pouze lymfocytární klony s funkčním imunokompetentním receptorem, které vykazují slabou afinitu k vlastním tkáňovým antigenům (tzv. pozitivní selekce) (viz obr. 6B).

Obr. 6 Vývoj lymfocytů a vznik lymfoproliferativních chorob:

A – vývoj B-lymfocytu

B – vývoj T-lymfocytu

MHC – major histocompatibility complex, BCR – B-cell receptor, TCR – T-cell receptor, T-AAL – akutní lymfoblastická leukemie, LBL – lymfoblastický lymfom, PTCL – periferní T-lymfom

Pozitivní selekce B-buněk a T-buněk je trochu odlišná. Pozitivní selekce T-buněk zaručuje, že dále budou vyzrávat jen ty T-lymfocyty, jejichž receptory rozpoznávají nejen vlastní MHC (u lidí HLA) molekuly, ale že také exprimují příslušné koreceptory (CD8 pro MHC gp I. třídy a CD4 pro MHC gp II. třídy). U B-linie vybírá pozitivní selekce takové buňky, které exprimují BCR. Principy negativní selekce jsou podobné u T- i B-linií – dochází při ní k eliminaci těch buněk, které vážou příliš silné vlastní antigeny.

Slabá signalizace z BCR či TCR do nitra buňky je nezbytná pro přežití lymfocytu v organismu. Tyto lymfocyty se označují jako tzv. naivní lymfocyty. Naivní lymfocyty následně recirkulují mezi krví a sekundárními lymfatickými orgány. V sekundárních lymfatických orgánech (např. uzlině) lymfocyty rolují po výběžcích folikulárních dendritických buněk, které vystavují na svých výběžcích nejrůznější exoantigeny, dopravené do uzliny tzv. antigen prezentujícími buňkami (např. monocyty) ze spádové oblasti dané uzliny. V případě, že se imunokompetentní receptor lymfocytu naváže na antigen vystavený např. v lymfatické uzlině, je daný lymfocyt v uzlině zadržen a prodělává další složitý vývoj, na jehož konci stojí zralá imunokompetentní buňka – cytotoxický T-lymfocyt nebo plazmatická buňka sekretující imunoglobuliny.

V průběhu diferenciace z naivního lymfocytu do imunokompetentní buňky dochází k několika komplexním dějům, které vysoce inklinují k mutagenezi (a tedy k lymfomagenezi). Jednak dochází v uzlině ke klonální expanzi při vytváření tzv. zárodečného centra (germinal center reaction), kdy z původně jednoho či několika lymfocytárních klonů vzniká „armáda“ stovek milionů či miliard imunokompetentních buněk. Klonální expanze je provázena vystupňovanou mitogenní aktivitou, která sama o sobě predisponuje ke vzniku náhodných chyb při přepisu DNA. Při klonální expanzi probíhá navíc diferenciace, při níž se komplexním způsobem mění genová exprese lymfocytu. Je nutné zdůraznit, že klonální expanze není pouhým „množením“ buněk, ale je provázena cíleným zvyšováním afinity imunokompetentních receptorů k antigenu a plánovanou změnou fenotypu lymfocytů.

Za zvyšování afinity TCR či BCR k antigenu je zodpovědný děj, který označujeme jako tzv. somatickou hypermutaci. Během ní dochází pomocí enzymu AID (activation-induced cytidine deaminase) k cílené bodové mutaci variabilních úseků BCR a TCR, které vážou antigen. Somatická hypermutace tudíž náhodným způsobem buď zvyšuje, nebo snižuje afinitu BCR či TCR k antigenu. Pouze takové lymfocytární klony, u nichž dojde ke zvýšení afinity, jsou stimulovány k další mitóze. Ostatní klony hynou v průběhu klonální expanze procesem apoptózy. V případě B-lymfocytů dochází v závěru diferenciace ještě k tzv. izotypovému přepnutí těžkých řetězců pro molekuly imunoglobulinu, v důsledku čehož se mění izotyp produkovaných molekul imunoglobulinu (nejčastěji z nízkoafinitních IgM na vysokoafinitní IgG).

Obr. 7 Rekombinace DNA a vznik imunoglobulinového receptoru

segmenty zárodečné DNA kódující imunoglobulinové receptory: V – variable, D – diversity, J – joining, C – constant; RAG – recombinase-activating genes, TdT – terminal deoxynucleotidyl-transferase, AID – activation-induced cytidine-deaminase, Ig – imunoglobulin, Fab – fragment vázající antigen, Fc – konstantní fragment

Podobně jako rekombinace DNA (v průběhu raného vývoje lymfocytu v kostní dřeni), také somatická hypermutace a izotypové přepnutí těžkých řetězců (v lymfatické uzlině) jsou spojeny s manipulací s DNA. Jakýkoliv zásah do DNA je vždy spojen s rizikem její mutace. Chybná aplikace somatické hypermutace může mít za následek somatickou mutaci buněčných onkogenů, např. transkripčního faktoru MYC. Chybná aplikace rekombinace DNA (enzymy RAG1/RAG2) či izotypového přepnutí těžkých řetězců (enzymem AID) může mít za následek vznik chromozomové translokace. V případě lymfomů se nejčastěji jedná o tzv. juxtapozice, kdy se nemutované geny (transkripčních faktorů, antiapoptotických genů apod.) dostávají pod vliv zesilovačů transkripce imunoglobulinových molekul či T-buněčných receptorů. Klasickým příkladem translokace nalézané u lymfomů je zvýšená exprese antiapoptotického genu BCL2 (B-cell lymphoma 2) u folikulárního lymfomu následkem translokace t(14;18), zvýšené exprese transkripčního faktoru MYC u Burkittova lymfomu následkem translokace t(8;14) nebo zvýšené exprese cyklinu D1 u lymfomu z plášťových buněk následkem translokace t(11;14).

Lymfoproliferace tudíž vznikají jako přímý důsledek chyb v průběhu složitého procesu adaptivní imunitní odpovědi a vznik celé řady lymfomů byl také jednoznačně asociován s chronicky probíhajícími záněty (chronická gastritida, chronický zánět střev, chronická sialoadenitida aj.).

1.7Apoptóza a její regulace

Apoptóza a nekróza představují dva základní vzájemně odlišné mechanismy buněčného zániku.

Nekróza je živelný proces nekontrolované buněčné dezintegrace v důsledku výrazných ireverzibilních zásahů, obvykle zvnějšku buňky (tepelný šok, osmotický šok apod.). Nekróza vede k nekontrolovanému rozpadu buňky a je následována výraznou zánětlivou reakcí.

Apoptóza (z řeckého apoptosis – opadávání listí), programová buněčná smrt, je naproti tomu aktivní, do jisté míry reverzibilní, proces vyžadující ATP. Apoptóza obvykle nevede k rozvoji zánětlivé reakce. Je to zcela nezbytný, evolučně velmi starý mechanismus, který vede k řízené eliminaci přestárlých, nefunkčních, nepotřebných, mutovaných, infikovaných či transformovaných buněk. Normální fungování apoptózy je nutné pro zdárný průběh embryogeneze a pro udržení homeostázy v postnatálním období.

Na rozdíl od nekrózy je apoptóza neimunogenní proces. V nádorové imunologii byl ale zaveden pojem imunogenní apoptóza, který vysvětluje, proč apoptotické nádorové buňky vyvolávají imunitní reakci. Celý proces je poněkud složitý. Nádorová buňka vlivem stresu (např. po antracyklinových antibiotikách) translokuje kalretikulin z endoplazmatického retikula na povrch. Taková buňka je pak rozeznávána „scavenger“ receptory v dendritických buňkách jako potenciálně nebezpečná a je fagocytována. Umírající nádorová buňka ještě vysílá signály, tzv. alarminy (např. HMGB-1 – high-mobility group box-1, nukleární protein vázající se na DNA), které se váží na TLR-4 (toll-like receptor) dendritických buněk. Tímto druhým signálem získává dendritická buňka pokyn k vyzrávání v antigen prezentující buňku, která vlastně započne imunitní reakci proti nádoru.

Deregulace apoptózy vede k řadě patologických stavů a je průvodním znakem většiny nádorových onemocnění. Evolučně se vyvinuly dvě hlavní apoptotické dráhy, označované jako receptorová (vnější, extrinzická) a mitochondriální (vnitřní, intrinzická). Obě dvě dráhy jsou spouštěny aktivací tzv. apikálních kaspáz (kaspázy jsou cysteinové proteázy, efektorové enzymy apoptózy). Vznik aktivních enzymů – kaspáz nastává štěpením neaktivních zymogenů – prokaspáz. Obě dvě apoptotické dráhy konvergují do společné apoptotické dráhy, která začíná aktivací tzv. efektorových kaspáz. Následně dochází k ireverzibilním strukturálním změnám buněčných komponent (štěpení aktinu, DNA apod.) a k řízené přeměně buňky v tzv. apoptotická tělíska.

1.7.1Receptorová apoptóza

Receptorová (extrinzická) apoptóza je spouštěna agregací tzv. smrtících receptorů (death receptors) – FAS/CD95, TNFR1/TNFRSF1A (tumor necrosis factor receptor/tumor necrosis factor receptor super family), TNFR2/TNFRSF1B, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5 aj.) v návaznosti na vazbu tzv. smrtících ligandů (death ligands) – FAS ligand, TNF, TNFSF10/TRAIL (tumor necrosis factor super family/tnf-related apoptosis-inducing ligand) (obr. 8A). Agregace smrtících receptorů vede k jejich internalizaci a vzniku multiproteinového efektorového komplexu zvaného DISC (death inducing signaling complex). V DISC dochází k autoaktivaci apikálních kaspáz (CASP8, CASP10), které následně štěpí efektorové kaspázy (CASP3, CASP7).

Receptorová apoptóza hraje klíčovou fyziologickou úlohu například při vývoji lymfatické tkáně: až 95 % thymocytů hyne v průběhu negativní selekce či absence pozitivní selekce v thymu indukcí smrtícího receptoru u FAS smrtícím ligandem FASL. Dále má receptorová apoptóza významnou fyziologickou regulační úlohu při klonální selekci naivního lymfocytu po setkání se specifickým antigenem v zárodečném centru lymfatické uzliny, neboť eliminuje lymfocyty s náhodně vznikajícími nefunkčními receptory. Defekty v receptorové apoptóze jsou asociovány s mnoha typy malignit. Mutace ve smrtícím receptoru FAS vedou ke vzniku autoimunitního lymfoproliferačního syndromu (ALPS) a byly popsány u pacientů s lymfomy (např. u velkobuněčného lymfomu z B-buněk – DLBCL).

1.7.2Mitochondriální apoptóza

Evolučně starší mitochondriální (intrinzická) apoptóza vznikla jako buněčný senzor defektů replikace, zejména mutací DNA. Mitochondrie je organela s vysokým obsahem kyslíkových radikálů (ROS) a proapoptotických molekul (cytochrom C, apoptosis inducing factor – AIF, endonukleáza G aj.). Za normálních okolností jsou tyto molekuly „uzavřeny“ v mitochondrii. Mitochondriální apoptóza je spouštěna disrupcí vnější mitochondriální membrány s následným vyplavením kyslíkových radikálů a proapoptotických molekul do cytosolu (obr. 8B). Dochází ke vzniku multiproteinového efektorového komplexu zvaného apoptozom, k autoaktivaci kaspázy 9 (CASP9) a k následnému štěpení (aktivaci) efektorových kaspáz (CASP3, CASP7).

Obr. 8 Schéma apoptózy:

A – receptorová/extrinzická apoptóza

B – mitochondriální/intrinzická apoptóza

FLIP – FLICE-inhibitory protein, CASP – kaspáza, DISC – death-inducing signaling complex, BAX – BCL2-associated X protein, BAK – BCL2-antagonist killer, BCL – B-cell lymphoma, MOMP – mitochondrial outer membrane permeabilization, IAP – inhibitor of apoptosis protein, SMAC – second mitochondria-derived activator of caspase

Aktivace společné apoptotické dráhy (aktivace CASP3, CASP7) znamená již definitivní přechod apoptózy v ireverzibilní fázi. Během této nevratné fáze nastává řízená degradace buněčných komponent aktivovanými kaspázami a jinými enzymy (endonukleázy, proteázy, poly-ADP-ribóza-polymeráza – PARP aj.). Dochází ke štěpení aktinu a dalších základních buněčných struktur, ke kondenzaci chromatinu, odštěpování membránových vezikul (tzv. membrane blebbing) a přeměně buněk v apoptotická tělíska, která jsou vzhledem ke zvýšené expresi fosfatidylserinu na vnějším listu buněčné membrány rozpoznána a fagocytována makrofágy a dalšími pomocnými buňkami bez významnějšího rozvoje zánětlivé reakce.

Apoptóza má v obraně proti malignitám zásadní a nezastupitelný význam. Fyziologicky má totiž každá buňka, která prodělala mutaci DNA, pouze dvě možnosti – buď vzniklý defekt DNA opraví a přežije, nebo k opravě DNA z různých důvodů nemůže dojít a buňka je z organismu eliminována apoptózou. Klíčovou úlohu v těchto dějích hraje tumor supresorový transkripční faktor p53 (viz dále). Až polovina solidních nádorů vykazuje defekt p53, avšak nejen mutace p53, ale obecně jakýkoli defekt apoptotické dráhy může vést k patologickému přežívání buněčných klonů s mutovanou DNA, a tudíž s vysokým rizikem vzniku a akumulace sekundárních mutací, maligní transformace a rozvoje nádorového onemocnění. Překoná-li maligní klon tuto vnitřní – apoptotickou „pojistku“ organismu, může být ještě eliminován zvnějšku – imunitním systémem (tumor immune-surveillance, viz výše). Při selhání této poslední linie obrany již šíření nádorového onemocnění nic nebrání.

Chemoterapie a radioterapie vyvolávají u nádorových buněk apoptózu zejména navozením genotoxického stresu (zástava replikace, zástava transkripce, indukce dvojitých zlomů DNA, alterace zásadních buněčných komponent). Dochází k aktivaci signální dráhy p53, indukci mitochondriální, ale i receptorové apoptózy (přes zvýšenou expresi smrtících receptorů) nebo k aktivaci tzv. stresových kináz (p38, JNK), které prostřednictvím upregulace proapoptotických proteinů snižují apoptotický práh postižených buněk a usnadňují spouštění a průběh apoptózy.

Alternativně mohou nádorové buňky odumírat také jinými způsoby buněčné smrti, jako je nekróza, autofagie nebo tzv. mitotická katastrofa (buněčná smrt krátce po dokončení mitózy způsobená akumulací příliš velkého množství mutací DNA). Tyto způsoby buněčné smrti nevyžadují funkční signální dráhu p53.

1.7.3Další buněčné apoptotické dráhy

Kromě receptorové a mitochondriální apoptózy byly v posledních letech popsány další významné buněčné apoptotické dráhy.

Apoptotická dráha endoplazmatického retikula (ER) je spouštěna stimuly, které vedou k narušení normální funkce ER (tzv. ER-stres). Endoplazmatické retikulum je organela s vysokým intraluminálním obsahem iontů Ca2+ a s výrazným oxidativním potenciálem. Dochází v něm ke tvorbě disulfidických můstků uvnitř polypeptidových molekul nově translatovaných proteinů, jakož i k jejich dalším úpravám (glykosylace, acetylace apod.) v průběhu skládání (folding) z lineární/2D konformace (unfolded protein) do prostorové/3D konformace (folded protein). Řada stresových stimulů – deplece glukózy, oxidativní stres, virová infekce, cytostatika (např. inhibitory proteazomu) – vyvolává akumulaci nesložených (unfolded) či špatně složených (misfolded) proteinů v luminu endoplazmatického retikula, což vede ke spuštění evolučně staré stresové dráhy nazývané UPR (unfolded protein response).

Následkem stresu endoplazmatického retikula dochází k uvolnění transmembránových molekul ukotvených v membráně ER, např. proteinů PERK (PKR-like ER kinase), IRE1 či ATF6. PERK inhibuje eIF-2α (eukaryotický iniciační transkripční faktor 2 alfa), což způsobí povšechnou zástavu transkripce (jedná se o adaptační mechanismus, který má snížit vstup dalších nesložených proteinů do endoplazmatického retikula). Transkripce některých genů je naopak selektivně zvýšena (např. ATF4, XBP-1, CHOP/GADD153). Dochází k adaptaci na vzniklou stresovou událost a v případě, že stresový práh překročí určitou hranici, nastává indukce apoptózy. IRE1 vazbou na adaptorový protein TRAF2 aktivuje signální dráhy stresových mitogenem aktivovaných proteinkináz (tj. p38 a JNK). Uvolnění kalcia z endoplazmatického retikula vede k aktivaci mnoha proapoptotických proteinů (např. kalpain cystein-proteáz). Komplexními mechanismy dochází k aktivaci proapoptotických BCL2 proteinů (jak BH3 only, tak BAX/BAK), inhibici antiapoptotických proteinů (BCL2, BCLX/BCL2L1, XIAP aj.) a štěpení apikálních kaspáz (CASP2, CASP8, CASP9) s následným přechodem do ireverzibilní fáze apoptózy.

Genotoxický stres (mutace, chromozomální translokace, zlomy DNA aj.) patří mezi nejsilnější aktivátory apoptózy. Kromě vlastní signální dráhy p53 (aktivované přes ATM/ATR a CHK1/CHK2) se na propagaci apoptotického signálu z poškozené DNA podílí též signální dráha kaspázy 2 (CASP2), která je jako jediná z kaspáz exprimovaná v jádře. Genotoxický stres indukuje tvorbu tzv. PIDDozomů, multiproteinových komplexů podobných DISC či apoptozomu (viz výše), složených z proteinů PIDD (p53-induced protein with a death domain), RAIDD (RIP associated Ich-1/CED homologous protein with death domain) a oligomerů CASP2. CASP2, aktivovaná v PIDDozomech, inhibuje průchod buňky buněčným cyklem (G_2-M kontrolní bod) a štěpí jiné apikální kaspázy (zejména CASP8), čímž snižuje práh na jiné proapoptotické stimuly.

1.7.4Regulátory apoptózy

Mezi hlavní buněčné regulátory mitochondriální apoptózy patří proteiny rodiny BCL2 (B-cell lymphoma 2) a proteiny IAP/BIRP (inhibitors of apoptosis proteins/baculoviral iap repeat containing protein).

Proteiny BCL2 se dělí na proapoptotické a antiapoptotické (tab. 2).

Tab. 2 Přehled BCL2 proteinů

Oficiální název

Alternativní názvosloví

Význam zkratky

Proapoptotické BH123 BCL2 proteiny

BAX

BCL2L4

BCL2-associated X protein

BAK1

BAK, BCL2L7

BCL2-antagonist/killer 1

Proapoptotické BH3-only BCL2 proteiny

BAD

BCL2L8, BBC2

BCL2-associated agonist of cell death

BID

BH3-interacting domain death agonist

BIK

BCL2-interacting killer

BCL2L11

BIM

BCL2-interacting mediator

BBC3

PUMA

BCL2-binding component 3

PMAIP1

NOXA

phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1

BMF

BCL2 modifying factor

HRK

harakiri

Antiapoptotické BCL2 proteiny

BCL2

B-cell lymphoma protein 2

BCL2L1

BCLX(L)

BCL2L2

BCLW

BCL2L10

DIVA, BOO, BCLB

BCL2A1

BFL1

BCL2-related protein A1

MCL1

BCL2L3

myeloid cell leukemia 1

BAG1

BCL2-associated athanogene

Proapoptotické BCL2 proteiny BAX a BAK jsou hlavní proapoptotické efektorové BCL2 proteiny. BAX a BAK mají schopnost vytvářet póry ve vnější mitochondriální membráně, čímž dochází k úniku kyslíkových radikálů a dalších proapoptotických molekul z mitochondrie do cytosolu a ke spuštění apoptózy. Jejich účinek je blokován vazbou antiapoptotických BCL2 proteinů (viz dále).

BH3-only BCL2 proteiny (BAD, BIM/BCL2L11, BID, PUMA/BBC3, NOXA/PMAIP1 aj.) tvoří další podskupinu proapoptotických BCL2 molekul. Proapoptotické BH3-only proteiny se váží na antiapoptotické BCL2 proteiny, čímž vytěsní (a tudíž uvolní) proapoptotické efektory BAX a BAK. Proapoptotické BH3-only proteiny hrají důležitou roli jako mediátory stresových signálů z vnějšího prostředí (např. osmotický a tepelný šok). Jsou také zvýšeně exprimovány a aktivovány při karenci růstových faktorů a základních živin (nízká hladina glukózy, aminokyselin aj.).

Antiapoptotické BCL2 proteiny (BCL2, MCL1, BCLX(L)/BCL2L1, BCLW/BCL2L2 aj.) blokují proapoptotické proteiny BAX a BAK tím, že se na ně fyzicky váží. Patologicky zvýšená exprese antiapoptotických BCL2 proteinů je typickým nálezem u celé řady malignit, zejména zralých lymfoproliferací (typicky zvýšená exprese BCL2 u folikulárního lymfomu či MCL1 u mnohočetného myelomu).

Proteiny IAP/BIRP tvoří vedle proteinů BCL2 další významnou skupinu regulátorů apoptózy (např. c-IAP1, c-IAP2, XIAP či survivin/BIRC5). Proteiny IAP inhibují apoptózu blokádou aktivních kaspáz a jsou zvýšeně exprimovány u celé řady nádorů.

1.8Autofagie

Autofagie je evolučně konzervovaná katabolická dráha zajišťující degradaci a eliminaci (v podstatě recyklaci) cytosolických proteinů, makromolekul a organel ve specifických lysozomech (autofagozomech). Autofagická degradace proteinových komplexů a organel je důležitým regulátorem buněčné homeostázy. Buňky s defektní autofagickou dráhou jsou zvýšeně náchylné na smrt v důsledku deprivace živin a růstových faktorů či kyslíku. Cílové struktury určené k degradaci jsou obaleny dvojmembránou a tvoří tak váčky nazývané autofagozomy. Ty pak fúzují s lysozomy, kde jsou cytoplazmatické proteiny degradovány. Dochází k proteolytickému štěpení organel a proteinových makromolekul na základní složky, kterých je využito jako metabolického paliva.

Základní funkcí autofagie je recyklace poškozených organel a přežití buňky v prostředí chudém na živiny či kyslík v souvislosti s vytvořením „metabolického paliva“, a to na základě degradace buněčných organel a multiproteinových komplexů. Nádorové buňky mohou díky aberantní aktivaci autofagie přežít stres způsobený nedostatkem živin či hypoxií (což jsou dvě základní vlastnosti mikroprostředí rostoucího nádoru). Inhibice autofagické dráhy se proto zkouší využít v rámci palety protinádorové terapie.

1.8.1Regulátory autofagie

Nejlépe prozkoumaným regulátorem autofagie je signální dráha PI3K-AKT-mTOR-mTORC1/2, klíčová kaskáda integrující signály z vnějšího prostředí a z nitra buňky. PI3K-AKT-mTOR patří mezi hlavní regulátory translace a buněčné proliferace (fosforylací eukaryotického elongačního faktoru 4E-BP1 a kinázy p70-S6) a v prostředí bohatém na živiny a růstové faktory tlumí autofagickou dráhu fosforylací kináz ULK1/2. V prostředí chudém na živiny dochází k aktivaci kinázy AMPK (AMP-activated kinase), aktivaci TSC2 (tuberous sclerosis protein) a následné inhibici komplexu TORC1 (transducer of regulated CREB activity). Aktivace autofagické dráhy může významně snižovat klinický efekt inhibitorů mTOR (mammalian target of rapamicine receptor) – rapamycinu, temsirolimu, everolimu aj.).

Mezi další spouštěče autofagie patří beclin (BH3-only BCL2 protein), p53 signální dráha (díky transaktivaci genu DRAM – damage-regulated autophagy modulator), hypoxie (přes HIF1α – hypoxia inducible factor), stres endoplazmatického retikula (přes unfolded protein response) a další buněčné dráhy.

Autofagie hraje v patogenezi kancerogeneze dvojí zdánlivě protichůdnou úlohu. Na jednu stranu vrozené či získané defekty v autofagické dráze usnadňují maligní transformaci, patrně v důsledku akumulace dysfunkčních proteinů a organel; na druhou stranu byla v populaci maligních buněk pozorována aberantní aktivace autofagie.

Možnosti inhibice autofagie jsou uvedeny v kapitole 8.5.2.

1.9Dvojí role p53 v inhibici onkogeneze

Tumor supresorový gen TP53, resp. jeho produkt – transkripční faktor p53, je klíčový nezastupitelný mediátor a částečně i efektor indukce apoptózy v odpovědi na signály:

- •genotoxického stresu (poškození DNA),

- •onkogenní signalizace (aberantní mitogenní stimuly).

Genotoxický stres – V případě, že dojde k poškození DNA (genotoxický stres), dochází k vazbě evolučně starých adaptačních proteinů na poškozenou DNA a následné aktivaci proteinových kináz ATM (ataxia teleangiectasia mutated) a ATR (ataxia teleangiectasia and Rad3 related) (obr. 9). „Checkpoint“ kinázy CHK1 a CHK2 signál genotoxického stresu amplifikují, což vede k aktivaci a stabilizaci transkripčního faktoru p53, jehož exprese je za normálních podmínek minimální. Faktor p53 se následně váže na DNA a mění expresi cílových genů jak ve smyslu transaktivace (např. p21CIP1, GADD45, 14-3-3 sigma, RPRM/reprimo, TRAILR2/DR5, BAX, PUMA, NOXA, FAS, PIDD), tak transreprese (např. BCL2, MCL1). Výsledkem je zástava buněčného cyklu, spuštění opravných mechanismů DNA a indukce mitochondriální apoptózy. Kromě výše popsaného navození proapoptotického stavu vyvolává p53 apoptózu částečně i přímo, vazbou na BCL2 antiapoptotické proteiny, čímž vytěsní z vazby na tyto proteiny proapoptotické efektory BAX a BAK. Popsané mechanismy se někdy označují jako genotoxická signální dráha p53 (neboli signální dráha genotoxického stresu).

Obr. 9 Signální dráha genotoxického stresu

ATM – ataxia telangiectasia mutated, ATR – ataxia telangiectasia and Rad3 related, CHK – checkpoint kinase, BRCA – breast-related cancer antigen, XRCC – X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells, BAX – BCL2-associated X protein, BER – base-excision repair, NHEJ – non-homologous end joining

Onkogenní signalizace – Abnormální mitogenní signály (např. aktivace onkogenů) způsobují kromě stimulace buněčné proliferace také transaktivaci evolučně starého tumor supresorového genu CDKN2A/p14ARF. Faktor p14ARF blokuje expresi, resp. indukuje degradaci proteinu MDM2 (mouse double minute – negativní regulátor p53), což vede k výraznému zvýšení transkripce a translace p53, jakož i k jeho posttranslačním modifikacím, které mají za následek zvýšení jeho stabilizace a snížení degradace. Popsanou kaskádu p14ARF – MDM2 – p53 označujeme jako negenotoxickou signální dráhu p53 (obr. 10).

Vážení čtenáři, právě jste dočetli ukázku z knihy Principy systémové protinádorové léčby.
Pokud se Vám líbila, celou knihu si můžete zakoupit v našem e-shopu.